Name: the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures
Uploaded: 2012-03-21T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, eo Swiss National Science Foundation (31003A-116624).

1. Criação de culturas organotípicas cerebelo Cultura de lâminas cerebelares são preparadas a partir de 8 dias pós-natal filhotes P (8) do rato utilizando o método de incubação estática 10. Em nosso laboratório, nós usamos B6CF1 ratos. Em algumas experiências ratinhos transgénicos também foram utilizadas as quais expressam EGFP selectivamente nas células de Purkinje. A preparação de culturas fatia demora cerca de 30 minutos por rato filhote, ou seja, 3 horas para u...

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Os métodos aqui apresentados permitem estudar Purkinje desenvolvimento de células dendríticas em culturas organotípicas do cerebelo e avaliar quantitativamente a expansão de células dendríticas Purkinje, medindo o tamanho da árvore dendrítica e o número de pontos de ramificação dendríticas. Naturalmente, uma análise mais completa e quantitativas sofisticadas de dendrites de células de Purkinje é possível, por exemplo, através da determinação comprimento dendrítico total, realizando uma análise de S...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Insere cultura de tecidos </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Os PICMORG50 pastilhas têm uma borda baixa e permitir a exibição de culturas vivas em um microscópio </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medum Águia </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol 12-myristate 13-acetato (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-di-hidroxi-fenil-glicina (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-calbindina D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti NeuN, clone A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

As células de Purkinje são um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento dendrítico, porque têm uma árvore dendrítica impressionante, que é estritamente orientadas no plano sagital e desenvolve principalmente no período pós-natal, em pequenos roedores 3. Além disso, os anticorpos que estão disponíveis várias células de etiquetas selectiva e intensa de Purkinje, incluindo todos os processos, com anti-calbindina D28K sendo a mais amplamente utilizada. Para visualização dos dendritos em células vivas, os camundongos que expressam EGFP seletivamente nas células de Purkinje 11 estão disponíveis através Jackson laboratórios. Organotípicas culturas de células cerebelares fatia permitir a manipulação experimental fácil de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas, porque a maior parte da expansão da árvore dendrítica de células dendríticas Purkinje realmente está ocorrendo durante o período de cultivo 4. Apresentamos aqui um protocolo curto, confiável e fácil de visualizar e analisar a morfologia dendrítica de células de Purkinje crescido em organotypic cerebelares culturas fatia. Para muitos fins, uma avaliação quantitativa da árvore dendrítica célula de Purkinje é desejável. Nós nos focamos em dois parâmetros, o tamanho da árvore dendrítica e números de ponto de desvio, que pode ser rápida e facilmente determinados a partir de anti-calbindina manchadas culturas fatia do cerebelo. Estes dois parâmetros produzir uma medida fiável e sensível de mudanças da árvore de Purkinje de células dendríticas. Utilizando o exemplo de tratamentos com a proteína-quinase C (PKC) e PMA activador do receptor de glutamato metabotrópicos 1 (mGluR1) é mostrado como as diferenças no desenvolvimento dendríticas são visualizadas e quantitativamente avaliados. A combinação de a presença de uma árvore dendrítica extensa, métodos selectivos e imunorreatividade intensa, as culturas organotípicas de fatias que cobrem o período de crescimento dendrítico e um modelo de rato com Purkinje expressão EGFP célula específica tornar as células de Purkinje de um sistema poderoso modelo para revelar os mecanismos de dendritic desenvolvimento.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Apresenta-se um protocolo que permite visualizar e para avaliar quantitativamente a morfologia da árvore dendrítico das células de Purkinje individuais crescidas em culturas organotípicas do cerebelo. Este protocolo destina-se a promover estudos sobre os mecanismos de Purkinje desenvolvimento de células dendríticas.

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

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Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

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Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

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Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

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Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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