Name: the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures
Uploaded: 2012-03-21T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por la Universidad de Basilea, del Departamento de Biomedicina, y la Swiss National Science Foundation (31003A-116624).

1. Configuración de organotípicos cultivos de cortes cerebelosos Cultivos cerebelares rebanada se preparan a partir día postnatal 8 P (8) crías de ratón utilizando el método de incubación estática 10. En nuestro laboratorio utilizamos B6CF1 ratones. En algunos experimentos los ratones transgénicos también se utilizaron que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje. La preparación de cultivos de corte es de unos 30 minutos por cada ratón cachorro, es decir,...

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Los métodos aquí presentados permiten estudiar el desarrollo de células de Purkinje dendríticas en cultivos de cortes organotípicos cerebelares y para evaluar cuantitativamente la expansión Purkinje de células dendríticas mediante la medición de tamaño de árbol dendrítico y el número de puntos de ramificación dendríticas. Por supuesto, un análisis cuantitativo más amplio y sofisticado de las dendritas de células de Purkinje es posible, por ejemplo, determinando la longitud dendrítica total, realizando...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Insertos de cultivo de tejidos </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Los PICMORG50 insertos tienen un borde bajo y permitir la visualización de las culturas vivas en un microscopio </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basal de Eagle Meidum </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> El suero de caballo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol 12-myristaTE-13-acetato (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-dihidroxi-fenilglicina (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-calbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Lucha contra NeuN, clon A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> De conejo anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Células de Purkinje son un sistema de modelo atractivo para el estudio de desarrollo dendrítico, porque tienen un árbol dendrítico impresionante que es estrictamente orientada en el plano sagital y se desarrolla principalmente en el periodo postnatal en roedores pequeños 3. Además, los anticuerpos se encuentran disponibles varios que selectivamente y de forma intensiva marcar células de Purkinje, incluyendo todos los procesos, con anti-Calbindin D28K siendo el más ampliamente utilizado. Para la visualización de las dendritas en las células vivas, los ratones que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje 11 están disponibles a través de los laboratorios Jackson. Organotípicos culturas cerebelosos rebanada células permiten una fácil manipulación experimental de desarrollo Purkinje células dendríticas porque la mayor parte de la expansión dendríticas del árbol dendrítico de células de Purkinje que de hecho ocurre durante el período de cultivo 4. Presentamos aquí un protocolo corto, fiable y fácil para la visualización y el análisis de la morfología dendrítica de las células de Purkinje crecido en organotypic cultivos de cortes cerebelosos. Para muchos fines, una evaluación cuantitativa del árbol dendrítico de células de Purkinje es deseable. Nos centramos aquí en dos parámetros, tamaño del árbol dendrítico y los números de punto de ramificación, que puede ser rápidamente y fácilmente determinadas a partir de anti-calbindina cultivos teñidos rebanada cerebelosos. Estos dos parámetros obtener una medida fiable y sensible de los cambios del árbol de células dendríticas Purkinje. Usando el ejemplo de los tratamientos con la proteína quinasa C PMA (PKC) y el activador del receptor de glutamato metabotrópico 1 (mGluR1) se demuestra cómo las diferencias en el desarrollo dendrítico se visualizan y evaluó cuantitativamente. La combinación de la presencia de un árbol dendrítico extensa, los métodos selectivos y de inmunotinción intensa, cultivos organotípicos rebanada que cubren el período de crecimiento dendrítico y un modelo de ratón con expresión de células de Purkinje EGFP específico hacer las células de Purkinje un sistema modelo de gran alcance para revelar los mecanismos de la dendríticas desarrollo.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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