Name: identification of protein interacting partners using tandem affinity purification
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الزمالة ويلكوم ترست كبار منحت للدكتور إيان Goodfellow.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تقنية العنونة وات يتضح هنا يدل على طريقة محددة للغاية وصرامة لعزل شركاء ملزم للبروتينات الطعم في الخلايا حقيقية النواة. ويمكن تطبيق هذا النهج على البروتينات الخلوية والفيروسية. على حد علمنا، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تطبيق هذه التقنية لعامل eIF4E ترجمة بدء. تحديد eIF4G eIF4E البروتينات ملزم المعروفة و4EBPs وباستخدام هذه التقنية ويؤكد على صحة هذا النهج. وبالإضافة إلى ذلك، وتحديد العنصر المتبقي من مجمع eIF4F، وهي eIF4A، وPABP يؤكد ان التفاعل غير المباشر ومجمعات التعليم العالي، لا تزال سليمة خلال عملية تنقية. وكان التعرف على الأشكال الإسوية متعددة من البروتينات الكنسي ملزم eIF4e واضحة أيضا. يتم وصف هذه في مزيد من التفاصيل في الشكل 2. فيما يتعلق بالقيود على النهج، ينبغي توخي الحذر معينة فيما يتعلق باختيارمن البروتين و الطعم. أو عدم وضع علامة TAG في N-أو محطة-C قد يكون من المستحسن لإجراء فحص وظيفي أو دراسة توطين انصهار بروتين بواسطة المجهر قبل تنقية النطاق الكامل لضمان مشتق الموسومة هو وظيفي. قد لا يتجزأ أو بروتينات غشاء نووي بالضرورة أن صدر عن ظروف منظف معتدل نسبيا وصفها في خطوة تحلل. كما هو الحال مع جميع immunoprecipitations وفحوصات مماثلة المنسدلة، يمكن إجراء تعديلات على طبيعة وتركيز المنظفات في المخزن المؤقت تحلل إلى زيادة كفاءة تحلل. ويمكن أيضا تركيز أيوني للمخازن وتحلل الغسيل يمكن تعديلها لزيادة أو نقصان صرامة للتنقية. ومن الممكن أيضا لأداء تنقية أولية تحت ظروف معتدلة معيار (المذكورة أعلاه) ولكن بعد ذلك تفرق الخرز streptavidin (القسم 5.8) في aliquots 4-5، والتي يمكن بعد ذلك يتم غسلها تحت يخدع الأيونية زيادةditions. هذا قد تمكن المستخدم من تحديد الظروف المثلى التي تعمل على إزالة غير محددة البروتينات المتفاعلة. ويمكن أيضا أن العملية برمتها يمكن تنفيذها باستخدام ترنسفكأيشن عابر حيث من المعروف أن الشركاء التفاعل وجودها أو عدم وجود يحددها طخة غربية لاحقة فقط. في هذه الحالة نقترح 2 100cm 2 أطباق من الخلايا كل transfected مع 8 ميكروغرام التعبير البلازميد. هذا الإجراء هو تعديل للاستخدام خاص عند النظر في قدرة المشتقات متحولة من البروتين TAP-انصهار للتفاعل مع شركاء ملزم معروف. تحليل عينات من 1 إلى 8 في المواد الهلامية الفضة SDS-PAGE الملون (أو لطخة غربية ما إذا كان الجسم المضاد هو متاح) هو وسيلة ممتازة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، يجب أن تفشل هذه التقنية لتوليد نتائج مقبولة. ويمكن تحليل كفاءة كل هطول الأمطار تقارب القائم وشطف محددة باستخدام هذا النهج أخذ العينات بطريقة منهجية. وينبغي أخذ عينات 1-8 خلال OPTIMسعودة للبروتوكول لكل بيت جديد. تقنية العنونة البرنامج يوفر بديلا قويا وقوية لمناهج أخرى مثل ضريبة السلع والخدمات سحب هبوطا، خميرة 2 المقايسات هجين وما إلى ذلك. تنقية تقارب مزدوجة وخطوات محددة شطف (انشقاق TEV وشطف البيوتين) توفير خصوصية وصرامة على الإبقاء على ارتفاع مستوى طوال الإجراء تنقية. ويمكن للغاية أن تطبق هذه التقنية إلى أي بروتين، ويمثل ذلك وسيلة ممتازة للتعرف على شركاء ملزم لهدف بروتين من الفائدة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> هيغروميسين B </td><td> روش </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> أرنب مفتش الاغاروز </td><td> سيغما </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV البروتياز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> البروتيني المانع كوكتيل </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> مشلول Ultralink Streptavidin الخرز زائد </td><td> ثقب </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 المكثف الطرد المركزي (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest عدة الفضة تلطيخ </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex صمغي تلطيخ Coomassie الأزرق عدة </td><td> إينفيتروجن </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml أنابيب prelubricated</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapillary نصائح ماصة </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12٪ مكرر تريس التدرج المواد الهلامية </td><td> إينفيتروجن </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> سيغما </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5X الواق SDS عينة </td><td> الصياد </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

والخطوة الحاسمة، والحد من كثير من الأحيان في فهم وظيفة المضيفة والبروتينات الفيروسية هو تحديد التفاعل شركاء بروتين خلوي أو فيروسي. هناك الكثير من النهج التي تتيح التعرف على شركاء التفاعل، بما في ذلك نظام هجين 2 الخميرة، وكذلك سحب المقايسات كما انخفض استخدام البروتينات المؤتلف ومناعي للبروتينات الذاتية تليها تحديد قياس الطيف الكتلي 1. وقد أبرزت الدراسات الحديثة فائدة مزدوجة تقارب العلامة تنقية بوساطة، إلى جانب اثنين من الخطوات شطف محددة في تحديد البروتينات المتفاعلة. واستخدمت في البداية لهذا النهج، ووصف تنقية الانجذاب جنبا الى جنب (وات)، في خميرة 2،3 لكن في الآونة الأخيرة قد تم تكييفه لاستخدامه في خلايا الثدييات 4-8. كما إثبات المفهوم، من وضعنا تنقية تقارب جنبا إلى جنب (وات) طريقة استخدام جيدا تتميز ترجمة حقيقية النواة بدء القوات المسلحة الكونغوليةتور eIF4E 9،10. عامل ترجمة الخلوية eIF4E هو عنصر حاسم من مجمع eIF4F الخلوية العاملة في كاب يعتمد على بدء ترجمة 10. وتتكون العلامة وات المستخدمة في الدراسة الحالية من وحدتين G البروتين والببتيد streptavidin ملزم مفصولة فيروس إحفر التبغ (TEV) البروتيني تسلسل الانقسام. وتتكون العلامة وات المستخدمة في الدراسة الحالية من وحدتين G البروتين والببتيد streptavidin ملزم مفصولة فيروس التبغ إحفر (TEV) البروتيني تسلسل انشقاق 8. للتخلي عن الحاجة إلى جيل من خطوط الخلايا نسيلي، قمنا بتطوير نظام سريع يعتمد على التعبير عن برنامج المشورة التقنية الموسومة بروتين الطعم من البلازميد episomally حافظت على أساس pMEP4 (إينفيتروجن). وتمت السيطرة التعبير عن eIF4E الفئران الموسومة من هذا البلازميد باستخدام محرض كلوريد الكادميوم المروج metallothionein. تحلل الخلايا التعبير عن واللاحقة تنقية تقارب عبر الربط إلى Rabbit مفتش الاغاروز، TEV انشقاق الأنزيم البروتيني، الربط إلى الاغاروز streptavidin مرتبط واللاحقة شطف البيوتين تحديد البروتينات المحددة العديدة على ما يبدو إلى eIF4E المنسدلة (بالمقارنة مع السيطرة على خطوط الخلايا معربا عن علامة TAP وحدها). وقد تم الحصول على هويات من البروتينات عن طريق الاستئصال من العصابات من 1D SDS-PAGE واللاحقة جنبا إلى جنب مطياف الكتلة. وشملت العناصر التي تم تحديدها من البروتينات المعروفة eIF4E ملزم eIF4G و4EBP-1. وبالإضافة إلى ذلك، المكونات الأخرى للمجمع eIF4F، من هو الذي eIF4E تم تحديد عنصر، وهي eIF4A وبولي بروتين ملزمة. القدرة على تحديد ليس فقط يعرف شركاء الربط المباشر، فضلا عن الثانوية البروتينات المتفاعلة، يسلط الضوء على مزيد من جدوى هذا النهج في توصيف البروتينات من وظيفة غير معروفة.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

جنبا إلى جنب تقارب تنقية هو نهج قوي للتعرف على شركاء بروتين ملزمة. كدليل على المفهوم، تم تطبيق هذه المنهجية على eIF4E ترجمة جيدة تتميز عامل البدء إلى راسب المشترك العوامل الخلية المضيفة المشاركة في بدء الترجمة. ويتم تكييف هذه الطريقة بسهولة إلى أي بروتين خلوي أو فيروسي.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...