Name: identification of protein interacting partners using tandem affinity purification
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00
Duration: 10 min 2 s
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इस शोध वेलकम ट्रस्ट वरिष्ठ डॉ. इयान गूड के लिए सम्मानित किया गया फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

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	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

नल टैगिंग यहाँ सचित्र तकनीक का यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन चारा के बंधन भागीदारों को अलग करने के लिए एक अत्यंत विशिष्ट और कड़े विधि दर्शाता है. इस दृष्टिकोण दोनों सेलुलर और वायरल प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. हमारे ज्ञान करने के लिए, यह पहली बार एक ऐसी तकनीक अनुवाद दीक्षा कारक eIF4E को लागू किया गया है. ज्ञात eIF4E बंधनकारी प्रोटीन eIF4G और 4EBPs इस तकनीक का उपयोग कर की पहचान इस तरह के एक दृष्टिकोण की वैधता की पुष्टि करता है. इसके अलावा, शेष घटक eIF4F जटिल की पहचान, अर्थात् eIF4A, और PABP के पुष्टि की है कि अप्रत्यक्ष बातचीत और तृतीयक परिसरों शोधन प्रक्रिया के दौरान बरकरार रहेगा. विहित eIF4e बंधनकारी प्रोटीन के कई isoforms की पहचान भी स्पष्ट था. चित्रा 2 में और अधिक विस्तार में वर्णित हैं. दृष्टिकोण की सीमाओं के साथ संबंध है, कुछ देखभाल के साथ संबंध चुनाव के लिए ले जाया जाना चाहिएचारा प्रोटीन और चाहे या नहीं करने के लिए एन या सी - टर्मिनस पर टैग टैग जगह है. यह उचित हो सकता है एक कार्यात्मक परख करने या संलयन प्रोटीन का स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्ण पैमाने पर शुद्धि के लिए पहले की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें टैग व्युत्पन्न कार्यात्मक है हो सकता है. अभिन्न झिल्ली या परमाणु प्रोटीन जरूरी अपेक्षाकृत हल्के साबुन lysis कदम में वर्णित शर्तों के द्वारा नहीं जारी किया जा सकता है. सभी immunoprecipitations और इसी तरह पुल से नीचे assays के साथ के रूप में, और lysis बफर सेल की क्षमता वृद्धि में प्रकृति और डिटर्जेंट की सांद्रता के रूपांतरण किया जा सकता है. lysis और धोने buffers की ईओण एकाग्रता को बढ़ाने या शुद्धि की तंगी कम करने के लिए संशोधित की जा सकती है. यह भी मानक हल्के शर्तों (ऊपर वर्णित) के तहत प्रारंभिक शुद्धि करने के लिए संभव है, लेकिन बाद में 4-5 aliquots में streptavidin (5.8 अनुभाग) मोती, जो बाद में बढ़ती ईओण चुनाव के तहत धोया जा सकता है विभाजितditions. इस उपयोगकर्ता इष्टतम स्थिति है कि गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत को हटाने की पहचान करने के लिए सक्षम हो सकता है. पूरी प्रक्रिया को भी क्षणिक अभिकर्मक जहां बातचीत भागीदारों में जाना जाता है और उनकी उपस्थिति या अनुपस्थिति के बाद पश्चिमी धब्बा केवल द्वारा निर्धारित का उपयोग किया जा सकता है. इस मामले में हम दो कोशिकाओं प्रत्येक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के 8 μg से के साथ ट्रांसफ़ेक्ट की 100cm 2 व्यंजन सुझाव देना चाहूँगा. इस संशोधित प्रक्रिया विशेष रूप से उपयोग की है जब नल - संलयन के लिए जाना जाता है बंधन भागीदारों के साथ बातचीत प्रोटीन की उत्परिवर्ती डेरिवेटिव की क्षमता की जांच. 1 चांदी दाग ​​एसडीएस पृष्ठ जैल (या पश्चिमी धब्बा द्वारा अगर एक एंटीबॉडी उपलब्ध है) पर 8 के माध्यम से नमूनों का विश्लेषण समस्या निवारण का एक शानदार तरीका है, तकनीक के लिए स्वीकार्य परिणाम उत्पन्न विफल करना चाहिए. प्रत्येक संबंध आधारित तेज़ी और विशिष्ट क्षालन की दक्षता इस व्यवस्थित नमूने दृष्टिकोण का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. आठ नमूने OPTIM दौरान लिया जाना चाहिएप्रत्येक नए चारा के लिए प्रोटोकॉल के ization. नल टैगिंग तकनीक जीएसटी के रूप में अन्य तरीकों पुल चढ़ाव, दो संकर assays के खमीर डबल संबंध शुद्धीकरण और विशिष्ट क्षालन कदम (TEV दरार और बायोटिन क्षालन) के आदि विशिष्टता और कठोरता प्रदान करने के लिए एक पर बनाए रखा जा करने के लिए एक शक्तिशाली और मजबूत विकल्प प्रदान करता है शोधन प्रक्रिया के दौरान उच्च स्तर है. गंभीर किसी भी प्रोटीन के लिए इस तकनीक को लागू किया जा सकता है और इसलिए ब्याज की एक प्रोटीन लक्ष्य के लिए बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए एक शानदार तरीका का प्रतिनिधित्व करता है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक का नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td></tr><tr><td> Hygromycin बी </td><td> रॉश </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> खरगोश आईजीजी agarose </td><td> सिग्मा </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> एसी TEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल </td><td> Calbiochem </td><td> 539,134 </td></tr><tr><td> Ultralink streptavidin प्लस मोती स्थिर </td><td> पियर्स </td><td> +५३११६ </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 केन्द्रापसारक concentrator (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest चांदी धुंधला किट </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> NOVEX कोलाइडयन ब्लू Coomassie धुंधला किट </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml prelubricated ट्यूबों</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> विंदुक युक्तियाँ Microcapillary </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% बीआईएस Tris ढाल जैल </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> 2 CdCl </td><td> सिग्मा </td><td> २०२९०८ </td></tr><tr><td> 5x एसडीएस नमूना बफर </td><td> मछुआ </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

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Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

अग्रानुक्रम संबंध शुद्धीकरण प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण है. अवधारणा का सबूत के रूप में अच्छी तरह से विशेषता अनुवाद दीक्षा कारक सह वेग eIF4E मेजबान सेल कारकों अनुवाद दीक्षा में शामिल करने के लिए इस पद्धति लागू किया गया था. इस विधि को आसानी से किसी भी सेलुलर या वायरल प्रोटीन के लिए अनुकूल है.

प्रोटीन बातचीत मिलकर आत्मीयता शोधन का उपयोग पार्टनर्स की पहचान

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

कार्बनिक सॉल्वेंट और एसिटिक एसिड के बिना जी 250 Coomassie के साथ जैल में प्रोटीन की धुंधला

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Hsp104 के शोधन, एक प्रोटीन Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

विषयेतर प्रोटीन एक लघु bispecific आत्मीयता टैग द्वारा सुविधा शोधन

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

और प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन का उपयोग विशिष्ट एंडो और exoglycosidases की पहचान लक्षण वर्णन

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

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में प्रोटीन परिसरों की पहचान<em&gt; Escherichia कोलाई</em&gt; संयोजन में अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ अनुक्रमिक पेप्टाइड संबंध शुद्धीकरण का उपयोग

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

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प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल के आधार पर<sup&gt; 15</sup&gt; एन मेटाबोलिक लेबलिंग, immunoprecipitation, मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आत्मीयता मॉडुलन

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

आत्मीयता टैग पुनः संयोजक प्रोटीन के शोधन उच्च throughput

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

जीएसटी उनकी शुद्धि: पूर्ण लंबाई शुद्ध प्रोटीन उपज वाली एक दो कदम आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microscale Thermophoresis द्वारा बंधन आत्मीयता निर्धारण के प्रोटीन शुद्धीकरण मुक्त विधि

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

पुनः संयोजक प्रोटीन फँसाना चाहे का उपयोग फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन के लिए एक प्रोटोकॉल

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...