Name: identification of protein interacting partners using tandem affinity purification
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

Это исследование финансировалось Wellcome Trust старший стипендия присуждена д-р Ян Гудфеллоу.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Техника TAP пометки показано здесь демонстрирует очень конкретный и строгий метод выделения обязательными партнерами приманки белков в эукариотических клетках. Этот подход может быть применен как для клеточных и вирусных белков. Насколько нам известно, это первый раз, когда такая методика была применена к фактору eIF4E инициации трансляции. Идентификация известных eIF4E обязательным eIF4G белков и 4EBPs использовании этого метода подтверждает правильность такого подхода. Кроме того, идентификация оставшихся компонентов комплекса eIF4F, а именно eIF4A и PABP подтверждает, что косвенное взаимодействие и высшего комплексы остаются неизменными в процессе очистки. Определение нескольких изоформ канонического eIF4E белков была также очевидна. Они подробно описаны на рисунке 2. Что касается ограничения подхода, определенного следует проявлять осторожность в отношении выбораприманки белка и нужно ли поместить TAG тег в N-или С-конца. Было бы целесообразно провести функциональный анализ и изучение локализации гибридного белка с помощью микроскопа до полной очистки масштабе для обеспечения отмеченных производная функционала. Интегральные мембранные или ядерные белки, не обязательно быть освобожден относительно мягким моющим средством условиях, описанных в лизис шаг. Как и все immunoprecipitations и подобные выпадающие анализы, изменения могут быть внесены в характере и концентрации моющих средств в лизис буфера для повышения эффективности лизиса. Ионной концентрации лизис и мыть буфера также может быть изменена для увеличения или уменьшения жесткости очистки. Кроме того, можно выполнить начальную очистку при стандартных мягких условиях (описано выше), но впоследствии разделить стрептавидином шарики (раздел 5.8) на 4-5 порции, которые могут впоследствии быть вымыты при увеличении ионной конусловиях. Это может позволить пользователю определить оптимальные условия, которые удаляют неспецифические взаимодействия белков. Весь процесс также может быть выполнено с использованием временной трансфекции, где взаимодействующие партнеры известны, и их наличие или отсутствие определяется последующей западной пятном только. В этом случае мы предлагаем два 100см 2 блюда из каждой клетки трансфицированных с 8 мкг плазмиды экспрессии. Это изменение процедуры особенно полезны при изучении способности мутантных производных TAP-гибридного белка взаимодействовать с известными обязательными партнерами. Анализ образцов с 1 по 8 на серебро окрашенных SDS-PAGE гелей (или западный пятно, если антитела есть) является отличным способом для устранения неполадок, если техника не в состоянии генерировать приемлемые результаты. Эффективность каждого близость на основе осадков и конкретные элюирования могут быть проанализированы с помощью этого системного подхода выборки. Образцы 7:59 должно быть принято в течение Optimции протокола для каждой новой приманки. Техника TAP пометки обеспечивает мощную и надежную альтернативу другие подходы, такие как стоимость выпадающие меню, дрожжи двух гибридных анализы и т.д. двойной очистки близости и конкретные шаги элюирования (ТРВ декольте и биотин элюирования) обеспечивают специфику и жесткость будет поддерживаться на Высокий уровень всей процедуры очистки. Критически этот метод может быть применен к любой белка и, следовательно, представляет собой отличный способ для определения обязательных партнеров для белка-мишени интерес.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Гигромицину B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> Кролик IgG агарозном </td><td> Сигма </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-ТРВ протеазы </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Коктейль Ингибитор протеазы </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink Иммобилизованные стрептавидином Plus бисера </td><td> Прокалывать </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 центробежный концентратор (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest серебрения комплект </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex коллоидной Синяя окраска Кумасси комплект </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml prelubricated труб</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Микрокапиллярных наконечники </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% Bis-Tris градиент гели </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> Сигма </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5x Пример SDS буфера </td><td> Рыбак </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Тандем аффинной очистки является надежным подходом для идентификации связывания с белками партнеров. В качестве доказательства концепции, эта методика была применена к хорошо характеризуется фактор инициации трансляции eIF4E к сотрудничеству осадок факторов клетки-хозяина, участвующих в инициации трансляции. Этот метод легко адаптирована к любой сотовой или вирусных белков.

Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Очистка Hsp104, белка Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Идентификация и характеристика гликозилирования белков с использованием конкретных эндо-и exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Высокая пропускная способность очистки Affinity с метками рекомбинантных белков

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...