Name: silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

De financiering van NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 en R01 EY020856 Onderzoek om Blindheid Career Development Award en Tri-Institutionele Stem Cell Initiative voorkomen. HCLE cellijn voorzien met dank aan Dr Ilene Gipson. De auteurs willen graag Dr Aihong Liu bedanken Weill Cornell Medical College voor haar technische bijstand en begeleiding bij celkweek, Anthony Labissiere in het ziekenhuis voor Speciale Operaties voor haar technische bijstand met SEM beeldvorming, de Tissue Engineering Resource Center (TERC) op Tufts University voor technische ondersteuning met materiaal ontwikkeling, en de Cornell Centrum voor nanoschaal Wetenschap en Technologie Facility (CNF) voor hulp bij het silicium wafer productie.

1. Fabricage van Siliconen Rubber Mallen <ol><li> Maak of koop een gewenste topografische ondergrond voor het gieten. Voor deze publicatie een standaard 100 mm geëtst siliciumplak wordt beschreven (figuur 1). </li><li> Weeg polydimethylsiloxaan (PDMS) oppotten (component A) en katalysator (component B) oplossing in een 1:9 verhouding (9 g potgrond en 1 g katalysator), zoals bepaald in de gekochte kit. </li><li> Meng oplossingen voor uitharding proces te starten. </li><li> Plaats silicium oppervlak van een wafer binnen een casting schotel. </li><li> Weeg 4,5 g van PDMS oplossing op silicium wafer. </li><li> Spread PDMS oplossing aan 100 mm diameter gebied van de wafer oppervlak. </li><li> Kantel wafer te PDMS oplossing gelijkmatig te verspreiden. </li><li> Bedek wafer met diameter van 100 mm petrischaal deksel. </li><li> Plaats gieten setup in 60 ° C oven gedurende de nacht, waardoor er zeker van dat uitharding plaatsvindt op een vlakke ondergrond. </li><li> Plaats genezen PDMS / silicium wafer in 70% ethanolbad voor de verwijdering. </li><li> Beginnen met het verwijderen van PDMS wafer door gebruik te maken scheermesje naar de rand van (gehele omtrek) eerst op te heffen. </li><li> Trek voorzichtig PDMS uit met pincet binnen een 70% ethanol bad zorg dat u siliconenrubber gieten scheuren. </li><li> Punch Out individuele PDMS vormen met behulp van 14 mm perforator. Deze diameter is ontworpen om te passen in een 24-wells plaat setup. </li></ol> 2. De productie van zijde oplossing <ol><li> Breng 2 liter gedestilleerd water (dH 2 O) aan de kook in een glazen beker 7. </li><li> Snijd 5 g van Bombyx mori zijderups cocons in drieën. </li><li> Gooi uitgebreid besmet cocons, zoals aangegeven door een te grote insecten deeltjes het bekleden van het inwendige cocon oppervlak. </li><li> Meet 4,24 g natriumcarbonaat. </li><li> Voeg langzaam natriumcarbonaat tot het kookpunt dH 2 O volume om over te koken van water te voorkomen, en laat het volledig is opgelost voordat u verder gaat. </li><li> Voeg cocon stukken aan de kook dH <sub&gt; 2 O voor 40 minuten., en gebruik een teflon bekleed roerstaafje om cocons roeren tijdens het koken proces. </li><li> Na het koken goed uitlekken dH 2 O in de gootsteen en de ring uit de zijde-extract met de hand om het overtollige water te verwijderen. </li><li> Was zijde driemaal extract gedurende 20 minuten. elk in 1 L van dH 2 O in een lab beker, en gebruik een roervlo om het volume te circuleren binnen de beker. </li><li> Na het wassen, ring uit de zijde-extract met de hand en plaats zijde fiber-extract in een chemische kap mogelijk te maken voor het drogen voor een 12 uur. periode. </li><li> De volgende dag, wegen de gedroogde zijde vezels, die typisch is ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Bereid 9,3 M LiBr oplossing voor een 20% w / v oplossing van zijde. Gebruik volgende vergelijkingen de nodige gewicht en volumes te berekenen: <ol class="lalpha"><li> (Silk-extract gewicht van stap 10) x (4) = ___________-mL van het totaal 9,3 M LiBr oplossing </li><li> [(807.705) x (LiBr volume van deel 11, A)] / 1000 = ___________ g LiBr toe te voegen aan dH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Voeg gemeten LiBr gewicht in een glazen beker van de volgende dH 2 O volume: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (berekende volume van stap 11, A) = ___________ ml dH 2 O </li></ol></li><li> Giet deze oplossing in een geschikt formaat maatcilinder, en Breng de oplossing tot aan de uiteindelijke volume, zoals berekend in het kader 11.a. </li><li> Plaats de zijde-extract in de beker en giet LiBr oplossing over de zijdevezels zorg ervoor dat de zijde vezels worden ondergedompeld in LiBr oplossing met behulp van een lab spatel. </li><li> Plaats de opgeloste zijde in 60 ° C oven gedurende 4 uur: Start tijd: ___________ Eindtijd: ___________ </li><li> Met behulp van een geschikte grootte spuit het opstellen van 12 ml van de zijde oplossing. Plaats een 18G naald op het einde van de spuit, en vervolgens de oplossing te injecteren in een dialyse cassette (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Na het vullen van de cassette, trekken de resterende lucht uit de cassette met de lege spuit. </li><li> Plaats filled dialyse cassette binnen 1 L van DH 2 O. </li><li> Wijzig dH 2 O volume na 1 uur, 4 uur, 8 uur en vervolgens om 12 uur 3x voor een totaal van 6 veranderingen: <ol class="lalpha"><li> Begin: ___________ </li><li> 1 uur: ___________ </li><li> 4HR: ___________ </li><li> 8 uur: ___________ </li><li> 12 uur: ___________ </li><li> 12 uur: ___________ </li><li> 12 uur: ___________ </li><li> Einde: ___________ </li></ol></li><li> Na dialyse, langzaam het verzamelen van de zijde oplossing van cassettes met een spuit. Plaats oplossing in 10.000 g beoordeeld centrifugebuizen. </li><li> Centrifugeer tweemaal de oplossing bij 10.000 g bij 4 ° C gedurende 20 min elk. Na elke centrifugeren plaats supernatant in een nieuwe buis. </li><li> Store THR zijde oplossing in 4 ° C koelkast. </li><li> Pipetteer 2 monsters van 0,5 ml zijde oplossing in kleine wegen schotel, en plaats af te wegen gerechten in een 60 ° C droge oven gedurende 12 uur of totdat de zijde oplossing droogt. </li><li> Weeg het resterende vaste zijde film uit both monsters zijde oplossing procent gewicht te meten om het volume te eiwitconcentratie: <ol class="lalpha"><li> Gewicht van de gecombineerde 2 zijde film monsters: ___________ mg </li><li> (Gewicht van 23.A) x (100) = ___________% zijde </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van Silk Films en Cultuur System Setup <ol><li> Bereid PDMS casting oppervlakken door reiniging met doorzichtige tape om stof te verwijderen. </li><li> Schoon PDMS substraten door het weken in 70% EtOH en was drie keer met dH 2 O. </li><li> Plaats 14 mm PDMS mallen op houder plaat, die typisch is een 24-wells plaat deksel. </li><li> Om een 50 micrometer dikke film te produceren, 70 μls van 8% zijde oplossing verspreid over PDMS mallen met behulp van een vloeistof verspreiden instrument dat typisch is een 1 ml spuit 2. </li><li> Laat de zijde films te drogen onbedekt een schone bank waarop een luchtstroom druk van 150 Pa gedurende 90 min of tot films droog. </li><li> Zodra films zijn droge plaats geheel van de films, waaronder PDMS moud, in een water-annealen kamer voor&gt; 4 uur aan een in water onoplosbare folie. Dit is typisch een lege kamer exsiccator met water in de bodem van het bassin getrokken in een 25 kPa vacuüm 15. </li><li> Verwijder de zijde films uit het water-gloeien kamer en plaats op een schone bank. </li><li> Bereid een 70% EtOH bad binnen een 35 mm petrischaaltje, en plaats controle substraten (dat wil zeggen glas of plastic oppervlakken) en roestvrij stalen ringen in putten voor ten minste 10 minuten te steriliseren. </li><li> Verwijder de zijde films uit PDMS mallen met behulp van een tang, dompel ze in 70% EtOH, en plaats monster in 24-wells plaat ingevuld met 1 ml van 70% EtOH ervoor te zorgen bedrukte zijde naar boven gericht is om voor celadhesie. </li><li> Na het plaatsen van elke zijde film monster in een overeenkomstige goed plaats roestvrij stalen ring gewichten (11,65 mm binnendiameter, 15.45 mm buitendiameter, en 1,18 mm dikte) op de top. </li><li> Laat monsters met ringen om incubeer gedurende 10 minuten om de steriliteit te garanderen. </li><li> Remove EtOH en was elk monster 3x met 1 ml PBS. Laat elke wasbeurt zitten voor 5 minuten om te zorgen voor volledige diffusie. </li><li> Verwijder PBS met behulp van glazen pipet opzuigen, terwijl zorg ervoor dat meerderheid van de luchtbellen te verwijderen onder zijde film monsters. </li><li> Bereid cellijn voor het zaaien. Als voorbeeld trypsinize menselijke cornea-limbale epitheel (HCLE) cellijn met 0,25% trypsine en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing van 7 min. Schakel trypsine met behulp van 01:01 volume van Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) passage media met 10% FBS toegevoegd. Centrifugeer getrypsiniseerd HCLE cellen, voeg 8-ml keratinocyt serum vrije media (K-SFM) naar celpellet, zachtjes schudden om HCLEs verspreiden, en het genereren van cellen. </li><li> Voorbeeld 500 pi van HCLE schorsing per putje meestal met behulp van een 10.000 cellen / cm 2 dichtheid. </li><li> Plaats culturen binnen incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 en voer de gewenste experimentele protocol. </li></ol> 4. Representatieve resultaten &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema illustreren verkorte 10-stap-proces van zijde filmproductie en cultuur systeem voorbereiding. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figuur 2. (A) 21-dye reeks patroon lijn oppervlak topografieën geproduceerd op een diameter van 90 mm ​​silicium wafer in dienst standaard fotolithografische en droge etstechnieken. (B) Silk films bewaart de originele parallelle lijn patroon functies na het gieten op PDMS vormen van oppervlakken. (C) Schematische tonen feature size ontwerp gekozen om cellulaire afstemming te bevorderen. (D) Doorsnede van zijde film illustreren behouden parallel gevoerd patroon oppervlak. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figuur 3. Rasterelektronenmicrografieën van HCLE cellijn vast te houden aan (A) patroonen (B) vlakke zijde films op dag 2 in cultuur. HCLE culturen blijven woekeren tot confluentie op (C) patronen en (D) vlakke oppervlakken op dag 8 in cultuur. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figuur 4. (A, D, G) met patroon en (B, E, H) vlakke zijde films cultuur HCLE cellen hoger dan bij (C, F, I) glas controle substraten bij (AC) dag 1, (DF) dag 4, en (GI) dag 8 in de cultuur. (J) CyQuant nucleïnezuur inhoud en (K) (3 - (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide (MTT) metabolisme assay gegevens blijkt HCLE levensvatbaarheid van zowel patroon en vlakke zijde filmsubstraten in vergelijking met glas stuurvlakken in de tijd (schaalbalken = 100 pm). Video 1. Time lapse fase-contrast beeldvorming van HCLE cellen migreren over een patroon zijde film oppervlak tijdens een 18 uur. periode. Cellen werden gezaaid op 10k/cm 2 dichtheid en gekweekt gedurende 2 uur. voor de beeldvorming. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Klik hier om de film te bekijken</a> . Video 2. Time lapse fase-contrast beeldvorming van HCLE cellen migreren over een vlakke TCP controle-oppervlak tijdens een 18 uur. periode. Cellen werden gezaaid op 10k/cm 2 dichtheid en gekweekt gedurende 2 uur. voor de beeldvorming. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Klik hier om de film te bekijken</a> .

<ol>
	<li>Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Fabrication+from+Bombyx+mori+Silk+Fibroin.">Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin.</a> Nature protocols. , (2011).</li><li>Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+methods+to+control+silk+fibroin+film+biomaterial+features.">Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features.</a> Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).</li><li>Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+biomaterials.">Silk-based biomaterials.</a> Biomaterials. 24, 401-416 (2003).</li><li>Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+fibroin+as+an+organic+polymer+for+controlled+drug+delivery.">Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).</li><li>Demura, M., Asakura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+glucose+oxidase+with+Bombyx+mori+silk+fibroin+by+only+stretching+treatment+and+its+application+to+glucose+sensor.">Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor.</a> Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+silk+protein+biomaterial+systems+for+optical+devices.">Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices.</a> Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).</li><li>Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+responses+to+silk+films+in+vitro+and+in+vivo.">The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 26, 147-155 (2005).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).</li><li>Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+behavior+of+porous+silk+fibroin+sheets.">Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.</a> Biomaterials. 24, 357-365 (2003).</li><li>Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Bombyx+mori+silk+fibroin+fibers+and+films.">Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films.</a> Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).</li><li>Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+biomaterials+for+cornea+tissue+engineering.">Silk film biomaterials for cornea tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).</li><li>Ma, X., Cao, C., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+silk+fibroin+films+containing+sulfonated+silk+fibroin.">The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).</li><li>Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+single-cell+interactions+with+microtopographical+cues.">Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues.</a> Biomedical. , (2010).</li><li>Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Stable+Silk+Films+with+Reduced+&#x03B2;-Sheet+Content.">Water-Stable Silk Films with Reduced &#x03B2;-Sheet Content.</a> Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).</li><li>Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Hydration+on+Silk+Film+Material+Properties.">Effect of Hydration on Silk Film Material Properties.</a> Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+silk+fibroin+as+a+support+for+enzyme+immobilization.">Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization.</a> Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+the+fibroin+of+Bombyx+mori+with+trypsin.">Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin.</a> Biochemical Journal. 93, 45 (1964).</li><li>Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy.">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li><li>Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes+as+potential+substrata+for+epithelial+constructs+used+in+the+management+of+ocular+surface+disorders.">Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).</li><li>Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Silk+Material+Structure+by+Temperature-Controlled+Water+Vapor+Annealing.">Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing.</a> Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).</li><li>Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+route+for+silk.">A new route for silk.</a> Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).</li><li>Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+equivalents+constructed+on+Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes.">Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes.</a> Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).</li><li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+at+a+distance:+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus.">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li><li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het gebruik van kunstmatige zijde films als een substraat voor celkweek heeft aan populariteit gewonnen in de afgelopen twee decennia als gevolg van uitgebreide karakterisering van de materiaaleigenschappen van dit eiwit en beter begrip van het biomateriaal nut 3,8. De cultuur hier beschreven systeem is een nieuwe in vitro testsysteem voor de beoordeling van het celoppervlak interacties op patroon zijde film biomateriaal substraten 7. Het systeem zorgt voor een diepgaande analyse van de cellulaire interacties in de tijd dat eenvoudig kan worden vastgesteld voor high-throughput het verzamelen van gegevens. Dit wordt grotendeels ingeschakeld omdat zijde films beschikken over een aantal van afstembare biomateriaal eigenschappen die kunnen worden aangepast om rechtstreeks van invloed zijn celfunctie 8,9,12, zoals: controle van oppervlakte micro / nano-oppervlakte topografie 7; verschillende oppervlakchemie door middel van covalente modificatie of adsorptie biologisch actieve moleculen 13; robuust mechanischeanical eigenschappen 15,16, controle van het materiaal hydrofiliciteit / hydrofobiciteit 16; bulk laden van biologische verbindingen voor release 4,8,17 en gecontroleerde ontbinding / enzymatische afbraak tarieven door middel van controle van de secundaire structuur (beta sheet inhoud) 11,18,19 . De transparantie zijde films wordt bereikt door zachtgloeien de films gedurende tijd onder vacuüm bij aanwezigheid van waterdamp 7,15. Deze verwerking kan benadering voor de vorming van β-sheet secundaire structuur, bevordering van de oplosbaarheid van het materiaal in water terwijl een minimale diffractie van licht 15. Deze transparantie van films is de sleutel in staat te stellen direct live-cell imaging die kunnen worden gebruikt onder een aantal beeldvormende technieken (dat wil zeggen wide-field en fluorescentie) met behulp van een willekeurig aantal microscoop systemen 12,20. Naast levende cellen beeldvorming, kan zijde films eenvoudig uit the cultuur systeem zorgen voor extra fixatie en analyse. Aldus de grote verscheidenheid van directe experimentele evaluatie kan worden uitgevoerd op dit systeem toepassing zijn op een grote verscheidenheid van cellen / weefsel bronnen voor vele technische velden 3,8,9,12,13,21. De tijdsverloop imaging resultaten illustreren real-time data cultuur worden verzameld en als voorbeeld werden gebruikt om te tonen hoe oppervlaktetopografie cel interacties beïnvloedt. De representatieve resultaten tonen hoe zijde film biomaterialen worden gebruikt om HCLE cultuur groei te ondersteunen en amendeerbaar een aantal standaard cellulaire proliferatie en metabolische assays (Fig. 4). Bovendien worden de kweken vastgesteld en verwerkt scanning elektronen imaging of andere protocollen (Fig. 3). Zijde film substraten worden in het laboratorium met hoge getrouwheid, consistentie en relatief goedkope (Fig. 1). Hierdoor reproduciheid in zowel cultuur-systeem installatie en experimentele resultaten. Het is aangetoond dat water-gloeien verwerking stabiele zijde filmmateriaal in cultuur aangetast, is gedefinieerd in afwachting de concentratie van proteasen in oplossing 2,15,22 produceert. Als gevolg van deze materialen kunnen worden gebruikt voor langere tijd voor langdurige celkweek, of blijven geïmplanteerd maanden of jaren afhankelijk fysiologische locatie 8. Bovendien heeft recent werk aangetoond dat zowel het eiwit en materiaaleigenschappen van water gehard zijde films stroken van partij tot partij waardoor reproduceerbare kweek zoals aangetoond door verschillende mechanische en biofysische testmethoden 15,16. Daarnaast is het materiaal van het oppervlak blijkt grote trouw onder de film partijen, zoals aangegeven door SEM, atomic force micrscopy (AFM), en onderzoeken in celculturen {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Materiaal stabilheid en consistentie is een belangrijke factor om de manier waarop de cel zal de cultuur substraat voelen door de verschillende mechanotransductie paden, en uiteindelijk een gewenste / ongewenste cellulaire respons 25,26. Historische normen voor cultuur substraten, zoals weefselkweek behandeld plastic of glas, voldoende substraten voor celhechting. Deze materialen kunnen niet gewijzigd verdere nut in vivo. Het kan gezien worden dat een zijde film biomateriaal kan worden aangepast in vitro, en als experimentele verwachtingen bereikt de aangepaste film kan direct worden omgezet in een in vivo model. Dergelijke gekoppeld ontwerp van in vitro en in vivo experimenten biedt een groot voordeel voor dergelijke implanteerbare zijde biomaterialen op andere substraten die routinematig worden gebruikt in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaalnaam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Silk cocons </td><td> Tajima Shoji Co, LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS monomeer en cross-linker </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Natrium Carbonaat </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> Lithiumbromide </td><td> Sigma </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 ml spuit </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> Roestvrij stalen ring </td><td> Superior Washer </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24-wells plaat </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

Silk films zijn veelbelovend eiwit gebaseerde biomaterialen die kunnen met hoge betrouwbaarheid en economisch worden vervaardigd in een laboratorium-omgeving 1,2. Deze materialen zijn wenselijk omdat ze een zeer beheersbare afmetingen en materiaaleigenschappen, biocompatibel en bevorderen celadhesie, kunnen worden gewijzigd door topografische patroon of chemisch wijzigen het oppervlak, en kan worden gebruikt als opslagplaats voor biologisch actieve moleculen drug delivery toepassingen 3-8. Daarnaast zijn zijde films zijn relatief eenvoudig om op maat ontwerpen, kunnen worden ontworpen om op te lossen binnen enkele minuten of na verloop van jaren in vitro of in vivo, en zijn te produceren met het extra voordeel dat het erg transparant in de natuur en daarom uitermate geschikt voor grafische toepassingen 9 - 13. De cultuur-systeem methodiek hier gepresenteerd is een schaalbare aanpak voor een snelle beoordeling van de cel-zijde filmoppervlakinteracties. Van bijzonder belang is het gebruik van oppervlak gevormde zijde films verschillen in celproliferatie en reacties van cellen voor aanpassing 12,14 bestuderen. De geplaatste cultures werden gekweekt op zowel micro-gevormde en vlakke zijde film substraten en beoordeeld via tijdsverloop fase contrast beeldvorming scanning elektronenmicroscopie en biochemische beoordeling van metabolische activiteit en nucleïnezuur inhoud. Kortom, de zijde film in-vitro-cultuur systeem biedt een aanpasbare experimentele opstelling geschikt zijn voor de studie van de cel-oppervlakte-interacties op een biomateriaal substraat, die vervolgens kunnen worden geoptimaliseerd en vervolgens vertaald in vivo modellen. Opmerkingen met behulp van de cultuur-systeem hier gepresenteerde worden momenteel gebruikt om te helpen bij toepassingen, variërend van basis-cel interacties aan medische apparatuur ontwerpen, en dus relevant zijn voor een brede waaier van biomedische terreinen.

Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films zijn een nieuwe klasse van biomaterialen gemakkelijk aan te passen voor een scala aan biomedische toepassingen. De gepresenteerde zijde filmcultuur systeem is zeer aangepast aan verschillende<em&gt; In vitro</em&gt; Analyses. Dit systeem is een biomateriaal ontwerp-platform aanbieden<em&gt; In vitro</em&gt; Optimalisatie voor directe vertaling naar<em&gt; In vivo</em&gt; Modellen.

Silk Film Culture-systeem voor In vitro Analyse en biomateriaal Ontwerp

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Een methode voor ovariële follikel Encapsulation en cultuur in een proteolytisch Afbreekbare 3 dimensionale systeem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematische analyse van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Het ontwerpen van Silk-zijde Protein Alloy materialen voor biomedische toepassingen

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro celcultuurmodel voor Toxic Geïnhaleerd chemische testen

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

Ontwerp en analyse voor de vereenvoudiging van het valdetectiesysteem

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...