Name: silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

במימון K08EY015829 NIH, R21EY019561, R24EY015656, EB002520 P41, ו R01 EY020856 מחקר למניעת עיוורון קריירה פיתוח פרס, ואת Tri-מוסדיים תא גזע היוזמה. שורת תאים HCLE סיפק באדיבות ד&quot;ר איילין Gipson. המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר Aihong ליו ב-Weill Cornell Medical College לקבלת סיוע טכני והדרכה אותה עם תרבית תאים, אנתוני Labissiere בבית החולים עבור ניתוחים מיוחדים לקבלת סיוע טכני שלה SEM הדמיה, הנדסת רקמות מרכז (TERC) בשעה טאפטס לעזרה טכנית עם פיתוח חומר, והמרכז קורנל ננו מדע וטכנולוגיה מתקן (CNF) לסיוע בייצור פרוסות סיליקון.

1. ייצור של תבניות גומי סיליקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר או לרכוש השטח הטופוגרפי הרצוי על הליהוק. לפרסום זה תקן 100 פרוסות סיליקון חרוט מ&quot;מ יתוארו (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את polydimethylsiloxane (PDMS) האיתות (רכיב) ו זרז (מרכיב ב) פתרון ביחס 1:09 (9 גרם האיתות ו 1 גרם זרז) כאמור ערכת לרכוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב פתרונות ליזום תהליך ריפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון במקום רקיק פני השטח בתוך צלחת הליהוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 4.5 גרם של הפתרון PDMS על גבי פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים PDMS פתרון כדי לכסות בקוטר 100 מ&quot;מ שטח של משטח פרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה רקיק להפיץ הפתרון PDMS באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים עם פרוסות סיליקון בקוטר 100 מ&quot;מ המכסה צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום להטיל את הגדרת 60 ° C בתנור במשך הלילה, לוודא כי ריפוי מתרחש על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום לרפא PDMS / סיליקון פרוסות סיליקון לתוך אתנול 70%אמבטיה לפני ההסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הסרת PDMS מ רקיק באמצעות סכין גילוח להרים קצה (היקף שלם) 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את PDMS באמצעות מלקחיים בתוך אמבטיה אתנול 70% נזהרים שלא לקרוע יציקת גומי סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרוף את הפרט תבניות PDMS באמצעות ניקוב חורים 14 מ&quot;מ. קוטר זה נועד להתאים את ההגדרה של 24 גם צלחת. </li></ol> 2. הפקה של פתרון ממשי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא 2 ליטר של מים מזוקקים (DH 2 O) לרתיחה בתוך הכוס זכוכית 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 5 גרם של Bombyx פקעות מורי תולעת המשי לשלישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את פקעות מזוהמים באופן נרחב כפי שצוין על ידי ציפוי חרק חלקיקים מוגברת פני המעטפת הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 4.24 גרם של סודיום קרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט לאט רותחים DH 2 נפח O למנוע רותחים על מים, ולאפשר פירוק מוחלט לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חתיכות המעטפת כדי ד&quot;ה רותחים <sub&gt; O 2 דקות 40., ולהשתמש בסרגל התרגשות מצופה טפלון לעורר פקעות בתהליך רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרתיחה, בזהירות לנקז DH 2 O לתוך הכיור וטבעת את תמצית משי ביד כדי להסיר עודפי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף משי לחלץ שלוש פעמים במשך 20 דקות. כל 1 ליטר של DH 2 O בכוס מעבדה, ולהשתמש בר ומערבבים להפיץ נפח בתוך הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכביסה, טבעת את תמצית משי בעבודת יד ומשי במקום תמצית סיבים בתוך מכסה המנוע הכימי, כדי לאפשר ייבוש במשך 12 שעות. נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשקול את סיבי משי יבשים, שהוא בדרך כלל ~ 3.5 גר &#39;: ___________-G </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 9.3 פתרון M LiBr לפתרון w / v 20% משי. לנצל את המשוואות הבאות כדי לחשב את משקל הדרוש כרכים: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (תמצית משי משקל משלב 10) x (4) = ___________-מ&quot;ל בסך הכל פתרון 9.3 LiBr M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [(807.705) x (נפח LiBr מחלק 11.a)] / 1000 = ___________ גרם LiBr להוסיף DH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת משקל LiBr נמדד לתוך כוס זכוכית של נפח הבאה DH O 2: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (0.8) x (נפח לחשב צעד 11.a) = ___________ מ&quot;ל של DH 2 O </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון הזה לתוך בגודל המתאים סיימה גליל, ולהביא פתרון עד נפח הסופי כפי שחושב בחלק 11.a. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תמצית משי לתוך הכוס ויוצקים פתרון LiBr על סיבי משי ולוודא סיבי משי שקועים בתוך פתרון LiBr באמצעות מרית במעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המשי התמוססו 60 מעלות צלזיוס בתנור במשך שעה 4: שעת התחלה: ___________ שעת סיום: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק בגודל המתאים להכין 12 מ&quot;ל של פתרון ממשי. הצב מחט 18G על סוף המזרק, ואז מזריקים לתוך פתרון casette דיאליזה (3500 coutoff MW, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). לאחר מילוי את הקלטת, לצייר את האוויר שנותר מתוך קלטת עם מזרק מרוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום Fiדיאליזה קלטת lled בתוך L 1 של DH 2 א &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה DH 2 נפח O אחרי 1 שעות, 4 שעות, 8 שעות ואז כל שעה 12 3x עבור סכום כולל של 6 שינויים: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעות: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4hr: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8 שעות: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 שעות: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 שעות: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 שעות: ___________ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיום: ___________ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי דיאליזה, לאט לאסוף את הפתרון משי קלטות עם מזרק. במקום הפתרון לתוך צינורות 10,000 גרם בדירוג צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה פתרון פעמיים גרם 10000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כל אחד. לאחר supernatant כל צנטריפוגה המקום לתוך צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות thr פתרון ממשי במקרר 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 דוגמאות של פתרון 0.5 משי מ&quot;ל לתוך צלחת משקל קטן, מקום לשקול מנות בתוך 60 מעלות בתנור יבש במשך 12 שעות או עד מתייבש פתרון ממשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הסרט הנותרים משי מוצקה בוטדגימות H כדי למדוד פתרון ממשי במשקל אחוז ריכוז החלבון נפח: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקל בשילוב של 2 סרטים דגימות משי: ___________ מ&quot;ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (משקל של 23.a) x (100) = ___________% משי </li></ol></li></ol> 3. הכנת סרטי משי מערכת ההתקנה תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין משטחים PDMS הליהוק על ידי ניקוי עם קלטת ברורה להסרת אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מצעים נקיים על ידי טבילה EtOH 70% ולשטוף שלוש פעמים עם DH 2 א &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 14 מ&quot;מ תבניות PDMS לצלחת המחזיק, שהוא בדרך כלל מכסה 24 הצלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר 50 מיקרומטר סרט עבה, להפיץ 70 μls של פתרון ממשי 8% על תבניות PDMS באמצעות כלי להפצת הנוזל הוא בדרך כלל 1 מ&quot;ל במזרק טיפ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר את הסרטים משי לייבוש שנחשפו על ספסל נקי פועל זרימת אוויר בלחץ של אבא 150 לתקופה של 90 דק &#39;או עד סרטים יבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם הסרטים הם מקום יבש כל קבוצה של סרטים, כולל PDMS מ &#39;בני, אל חדר מים חישול עבור&gt; 4 שעות כדי להפיק סרט מסיס במים. זה בדרך כלל תא תא ייבוש ריקה עם מים בחלקו התחתון של אגן משך ואקום 25 kPa 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סרטי משי מחדר מים חישול במקום על ספסל נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין אמבטיה EtOH 70% בתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ, בקרת מקום מצעים (כלומר זכוכית או משטחי פלסטיק) וטבעות נירוסטה בתוך בארות דקות לפחות 10 לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סרטי משי מתבניות PDMS באמצעות מלקחיים, לטבול אותם EtOH 70%, ואת המקום לתוך צלחת מדגם 24-prefilled גם עם 1 מ&quot;ל של EtOH 70% ביצוע בצד בדוגמת בטוח הוא פונה כלפי מעלה, כדי לאפשר הידבקות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ביצוע כל מדגם הסרט משי לתוך מקבילה גם מקום פלדה אל חלד משקולות טבעת (11.65 מ&quot;מ קוטר פנימי, קוטר חיצוני 15.45 מ&quot;מ, 1.18 מ&quot;מ עובי) על גבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר דגימות עם טבעות כדי לדגור במשך 10 דקות על מנת להבטיח סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמויש EtOH ולשטוף כל מדגם 3x עם 1 מ&quot;ל של PBS. בואו לשטוף את זה לשבת במשך 5 דקות, כדי לאפשר דיפוזיה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS באמצעות פיפטה זכוכית aspirating, תוך הקפדה להסיר מרבית בועות מתחת דגימות סרט משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הקו הסלולרי של זריעת. לדוגמה, אדם trypsinize הקרנית-limbal קו אפיתל (HCLE) תא עם טריפסין 0.25% וחומצה פתרון ethylenediaminetetraacetic (EDTA) דקות-7. בטל טריפסין שימוש 1:01 נפח שונה Dulbecco הנשרים בינוני (DMEM) מדיה המעבר עם FBS 10% נוסף. סרכזת תאים HCLE trypsinized, להוסיף 8-מ&quot;ל של keratinocyte-בסרום תקשורת חופשית (K-SFM) לתא גלולה, בעדינות להתסיס לפזר HCLEs, וליצור מספר התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מדגם μL ההשעיה HCLE לכל גם בדרך כלל באמצעות 10,000 תאים / ס&quot;מ 2 צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות מקום בתוך האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו להפעיל פרוטוקול הניסוי הרצוי. </li></ol> 4. נציג תוצאות &lt;בכיתה P = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> 1. תרשים זרימה תרשים הממחיש סיכם 10 שלבים בתהליך של ייצור משי הסרט ואת מערכת הכנה התרבות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> איור 2 (א) 21 צבע מערך של פני השטח בדוגמת topographies קו המיוצרים על פרוסות סיליקון בקוטר 90 מ&quot;מ סטנדרטי העסקת טכניקות תחריט photolithographic ויבש. (ב) סרטי משי לשמור על התכונות המקוריות שורות מקבילות בדוגמת לאחר הליהוק על משטחים PDMS דפוס. (ג) סכמטי הוכחת גודל עיצוב תכונה נבחר כדי לקדם את יישור התאים. (ד &#39;) חתך של סרט משי הממחישות שמרו על משטח מרופד בדוגמת במקביל. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> איור 3. סריקה micrographs אלקטרונים של קו תא HCLE עמידה (א) בדוגמתו (ב) סרטי משי שטוחה יום 2 בתרבות. תרבויות HCLE ממשיכים להתרבות עד המפגש ב (ג) בדוגמת (ד) משטחים שטוחים ביום 8 בתרבות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> איור 4. (A, D, G) בדוגמת (B, E, H) סרטים שטוחים משי תרבות HCLE תאים יחסית עד (C, F, I) שליטה מצעים הזכוכית היום (AC) 1, (DF) יום 4, ו (GI) יום 8 בתרבות. (י) חומצה CyQuant תוכן גרעין (K) (3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) מטבוליות assay פעילות נתונים הוכחת הכדאיות HCLE בשני בדוגמת ושטוח הסרט מצעים משי בהשוואה שליטה משטחי זכוכית לאורך זמן (ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר). וידאו 1. זמן לשגות שלב לעומת זאת הדמיה של תאים HCLE נודדות על פני השטח בסרט משי בדוגמת במהלך שעות 18. פרק זמן. התאים היו זרע בצפיפות 2 10k/cm ותרבותיים עבור שעה 2. לפני הדמיה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט</a> . וידאו 2. זמן לשגות שלב לעומת זאת הדמיה של תאים HCLE נודדים על פני TCP שטוח שליטה במהלך שעות 18. פרק זמן. התאים היו זרע בצפיפות 2 10k/cm ותרבותיים עבור שעות 2. לפני הדמיה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט</a> .

<ol>
	<li>Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Fabrication+from+Bombyx+mori+Silk+Fibroin.">Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin.</a> Nature protocols. , (2011).</li><li>Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+methods+to+control+silk+fibroin+film+biomaterial+features.">Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features.</a> Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).</li><li>Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+biomaterials.">Silk-based biomaterials.</a> Biomaterials. 24, 401-416 (2003).</li><li>Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+fibroin+as+an+organic+polymer+for+controlled+drug+delivery.">Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).</li><li>Demura, M., Asakura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+glucose+oxidase+with+Bombyx+mori+silk+fibroin+by+only+stretching+treatment+and+its+application+to+glucose+sensor.">Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor.</a> Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+silk+protein+biomaterial+systems+for+optical+devices.">Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices.</a> Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).</li><li>Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+responses+to+silk+films+in+vitro+and+in+vivo.">The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 26, 147-155 (2005).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).</li><li>Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+behavior+of+porous+silk+fibroin+sheets.">Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.</a> Biomaterials. 24, 357-365 (2003).</li><li>Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Bombyx+mori+silk+fibroin+fibers+and+films.">Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films.</a> Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).</li><li>Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+biomaterials+for+cornea+tissue+engineering.">Silk film biomaterials for cornea tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).</li><li>Ma, X., Cao, C., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+silk+fibroin+films+containing+sulfonated+silk+fibroin.">The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).</li><li>Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+single-cell+interactions+with+microtopographical+cues.">Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues.</a> Biomedical. , (2010).</li><li>Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Stable+Silk+Films+with+Reduced+&#x03B2;-Sheet+Content.">Water-Stable Silk Films with Reduced &#x03B2;-Sheet Content.</a> Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).</li><li>Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Hydration+on+Silk+Film+Material+Properties.">Effect of Hydration on Silk Film Material Properties.</a> Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+silk+fibroin+as+a+support+for+enzyme+immobilization.">Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization.</a> Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+the+fibroin+of+Bombyx+mori+with+trypsin.">Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin.</a> Biochemical Journal. 93, 45 (1964).</li><li>Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy.">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li><li>Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes+as+potential+substrata+for+epithelial+constructs+used+in+the+management+of+ocular+surface+disorders.">Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).</li><li>Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Silk+Material+Structure+by+Temperature-Controlled+Water+Vapor+Annealing.">Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing.</a> Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).</li><li>Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+route+for+silk.">A new route for silk.</a> Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).</li><li>Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+equivalents+constructed+on+Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes.">Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes.</a> Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).</li><li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+at+a+distance:+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus.">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li><li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השימוש סרטי משי שהתחדשו כמו המצע של תרבית תאים צברה פופולריות בשני העשורים האחרונים בשל אפיון נרחב של תכונות החומר של חלבון זה והגדילה הבנה של השירות שלה ביולוגי 3,8. מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה הרומן במערכת בדיקות במבחנה להערכת אינטראקציות פני התא על משי בדוגמת הסרט ביולוגי מצעים 7. המערכת מאפשרת ניתוח מעמיק של אינטראקציות הסלולר לאורך זמן, כי ניתן לאמץ בקלות איסוף נתונים תפוקה גבוהה. זו מתאפשרת בעיקר בגלל סרטי משי בעל מספר תכונות מתכונן ביולוגי כי ניתן לשנות באופן ישיר להשפיע על תפקוד התא 8,9,12, כולל: שליטה על פני מיקרו / ננו משטח הטופוגרפיה 7; chemistries השטח שונים באמצעות שינוי קוולנטי או ספיחה ביולוגית של מולקולות פעילות 13; הנדסת חזקיםתכונות anical 15,16; בקרה של hydrophilicity חומר / hydrophobicity 16, טוען רוב תרכובות ביולוגיות לשחרור 4,8,17 וכן פירוק מבוקר / שיעורי השפלה אנזימטיות באמצעות שליטה על המבנה המשני (תוכן גיליון בטא) 11,18,19 . השקיפות של סרטי משי מושגת באמצעות חישול הסרטים לתקופה של זמן תחת ואקום בנוכחות אדי מים 7,15. גישה זו מאפשרת עיבוד ליצירת מבנה β גיליונות משני, טיפוח insolubility של החומר במים תוך מתן אפשרות עקיפה מינימלית של אור 15. זו השקיפות של הסרטים הוא המפתח המאפשר הדמיה ישירה בשידור חי תאים שיכולים להיות מועסקים תחת מספר שיטות הדמיה (כלומר רחב שדה הקרינה) באמצעות מספר רב של מערכות מיקרוסקופ 12,20. בנוסף הדמיה חיה תאים, סרטי משי ניתן להסיר בקלות מן התרבות מערכת הדואר, כדי לאפשר ניתוח קיבוע נוסף. לכן, מגוון רחב של הערכות ניסיוניות ישירות כי ניתן לבצע במערכת זו החלות על מגוון רחב של תאים / רקמות מקורות עבור שדות טכניים רבים 3,8,9,12,13,21. את זמן לשגות תוצאות ההדמיה להמחיש כיצד נתונים בזמן אמת תרבות ניתן לאסוף, ובתור דוגמה נוצלו כדי להמחיש עד כמה הטופוגרפיה משטח משפיע על אינטראקציות התא. התוצאות מייצגות להדגים כיצד biomaterials סרט משי יכול להיות מנוצל כדי לתמוך בצמיחה תרבות HCLE, והם amendable למספר התרבות תאים סטנדרטיים מבחני מטבולית (איור 4). בנוסף, התרבויות קבועים ומעובדים לצורך סריקה והדמיה אלקטרונים או פרוטוקולים אחרים (איור 3). הסרט מצעים משי מיוצרים במעבדה עם איכות גבוהה, עקביות, עם עלות נמוכה יחסית (איור 1). זה מאפשר reproducibility בהגדרת התרבות גם מערכת ותוצאות הניסוי. הוכח כי מים לחשל עיבוד מייצרת משי יציבה הסרט בחומר תרבות הגדיר שיעורי השפלה ממתינים ריכוז של פרוטאזות בתמיסה 2,15,22. כתוצאה מכך חומרים אלה עשויים לשמש עבור פרקי זמן ארוכים של תרבות ארוכת טווח תאים, או להישאר מושתל במשך חודשים או שנים בהתאם למיקום הפיזיולוגי 8. בנוסף, העבודה האחרונה הראו כי הן את המבנה של חלבונים תכונות החומר של מים annealed סרטי משי עולים בקנה אחד מתוך אצווה כדי אצווה המאפשר תוצאות תרבות לשחזור כפי שמוצג באמצעות שיטות בדיקה שונות מכניים biophysical 15,16. בנוסף, פני השטח של החומר הראה נאמנות רבה בקרב קבוצות הסרט כפי שמצוין SEM, כוח אטומי micrscopy (AFM), ואת לימודי התרבות תאים {לורנס: 2008wr, Omenetto: 2008tc, בריי: 2011kq} 7,23,24. חומר stability ועקביות הוא גורם חשוב איך התא יהיה לחוש את מצע התרבות דרך מסלולים mechanotransduction שונים, ובסופו של דבר לייצר התגובה הרצויה / לא רצויה הסלולר 25,26. סטנדרטים היסטוריים מצעים תרבות, כגון פלסטיק רקמת התרבות טיפול או זכוכית, מספקים מצעים מתאימים עבור קובץ מצורף התא. עם זאת, חומרים אלה אינם amendable עבור השירות נוספת in vivo. זה יכול להיות שחזה כי משי הסרט ביולוגי יכול להיות מותאם אישית במבחנה, ופעם הציפיות הניסוי היה להשיג את הסרט מותאם אישית יכול להיות מתורגם ישירות במודל vivo. עיצוב זיווג כזה בין במבחנה ניסויים vivo מציע יתרון גדול על אלה biomaterials משי מושתלת על מצעים אחרים המשמשים שגרתי במבחנה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם החומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> פקעות משי </td><td> Tajima שוג&#39;י ושות&#39; בע&quot;מ. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS מונומר ו לעבור מקשר </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> סודיום קרבונט </td><td> סיגמא </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> ליתיום ברומיד </td><td> סיגמא </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל מזרק </td><td> בקטון, דיקנסון </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> מכונת כביסה נירוסטה </td><td> מכונת כביסה מעולה </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24 גם צלחת </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

סרטי משי מבטיחים חלבון מבוססי biomaterials זה יכול להיות מפוברק עם נאמנות גבוהה מבחינה כלכלית בתוך 1,2 מעבדת מחקר הסביבה. חומרים אלה רצוי כי הם בעלי מאפיינים ממדי חומר לשליטה מאוד, הם ביולוגית לקדם את הידבקות התא, ניתן לשנות באמצעות דפוסים טופוגרפית או על ידי שינוי כימי של פני השטח, והוא יכול לשמש מחסן של מולקולות פעילות ביולוגית לאספקת יישומים סמים הקשורות 3-8. בנוסף, סרטי משי הם פשוט יחסית עיצוב מותאם אישית, יכול להיות מתוכנן לפרק בתוך דקות או לבזות לאורך השנים או במבחנה in vivo, והם מייצרים עם מוסף של להיות שקוף בטבע, ולכן מתאים במיוחד עבור יישומי הדמיה 9 - 13. מערכת התרבות המתודולוגיה המוצגת כאן מייצג גישה להרחבה על הערכות מהירה של שטח פני התא משי הסרטאינטראקציות. מעניינת במיוחד היא השימוש פני סרטי משי בדוגמת ללמוד הבדלי התרבות התאים ואת תגובותיהם של תאים עבור יישור 12,14. התרבויות היו בתרבית זרע בשני מיקרו בדוגמת ושטוח הסרט מצעים משי, ולאחר מכן להעריך את ההדמיה שלב בניגוד זמן לשגות, סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים, והערכה ביוכימי של פעילות מטבולית ותוכן חומצות גרעין. לסיכום, סרט משי במערכת התרבות חוץ גופית מציעה התקנה ניסיונית להתאמה אישית מתאים ללימוד על פני קרום התא אינטראקציות על מצע ביולוגי, אז מה שיכול להיות מותאם ולאחר מכן לתרגם את במודלים vivo. תצפיות באמצעות מערכת התרבות המוצגת כאן כרגע בשימוש לסייע יישומים החל אינטראקציות סלולריים הבסיסיים לעיצוב מכשור רפואי, ולכן הם רלוונטיים למגוון רחב של תחומים ביו.

Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

סרטי משי הם קבוצה חדשה של biomaterials בקלות להתאמה אישית עבור מערך של יישומים ביו. הסרט הציג משי מערכת התרבות ניתנת להתאמה ביותר למגוון של<em&gt; במבחנה</em&gt; ניתוחים. מערכת זו מהווה הצעת ביולוגי פלטפורמת עיצוב<em&gt; במבחנה</em&gt; ייעול לפני בתרגום ישיר<em&gt; In vivo</em&gt; מודלים.

סרט משי תרבות מערכת במבחנה ניתוח ביולוגי עיצוב

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

תכנון וניתוח של מערכת גילוי סתיו פישוט

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...