Name: silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

La financiación de los NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520, y R01 EY020856 Investigación para Prevención de la Ceguera Premio al Desarrollo de Carrera, y Tri-Institucional Iniciativa de Células Madre. Línea celular HCLE proporcionados por cortesía de la Dra. Ilene Gipson. Los autores desean agradecer al Dr. Aihong Liu en Weill Cornell Medical College, por su asistencia técnica y orientación con el cultivo celular, Anthony Labissiere en el Hospital para Cirugías Especiales para su asistencia técnica con el SEM de imágenes, la Ingeniería de Tejidos del Centro de Recursos (TERC) en la Universidad de Tufts para el apoyo técnico con el desarrollo material, y el Centro de Cornell para la ciencia a nanoescala y el Fondo para la Tecnología (CNF) para obtener ayuda en la fabricación de obleas de silicio.

1. Fabricación de moldes de caucho de silicona <ol><li> Producir o adquirir una superficie topográfica deseada para la fundición. Para esta publicación un estándar de 100 mm de la oblea de silicio grabada se ha descrito (Figura 1). </li><li> Pesar polidimetilsiloxano (PDMS) encapsulamiento (componente A) y catalizador (componente B) solución en una relación 1:9 (9 g encapsulamiento y 1 g de catalizador) según lo dispuesto en el kit comprado. </li><li> Mezcle las soluciones de fondo para iniciar el proceso de curado. </li><li> Colocar oblea de silicio superficie dentro de un plato de colada. </li><li> Pesar 4,5 g de solución de PDMS sobre obleas de silicio. </li><li> Propagación PDMS solución como para cubrir un área de 100 mm de diámetro de la superficie de la oblea. </li><li> Incline la oblea para difundir solución de PDMS de manera uniforme. </li><li> Cubrir oblea con 100 mm de diámetro tapa placa de Petri. </li><li> Lugar de fundición de instalación en estufa a 60 º C durante la noche, asegurándose de que el curado se lleva a cabo sobre una superficie plana. </li><li> Colocar curado PDMS / obleas de silicio en 70% de etanolbaño antes de la eliminación. </li><li> Comienza la eliminación de PDMS de obleas mediante el uso de hoja de afeitar para levantar el borde (circunferencia) en primer lugar. </li><li> Tire suavemente de PDMS fuera de uso de fórceps en un baño de etanol al 70% teniendo cuidado de no romper la fundición de caucho de silicona. </li><li> Rompa los moldes individuales con PDMS 14 perforadora mm. Este diámetro está diseñado para encajar en una configuración de placa de 24 pocillos. </li></ol> 2. La producción de solución de seda <ol><li> Llevar 2 L de agua destilada (dH 2 O) a ebullición dentro de un vaso de vidrio 7. </li><li> Cortar 5 g de Bombyx mori capullos de seda en tres partes. </li><li> Elimine los capullos ampliamente contaminados por insectos, como se indica exceso de recubrimiento de las partículas en la superficie del capullo interior. </li><li> Medir 4,24 g de carbonato de sodio. </li><li> Añadir carbonato de sodio lentamente hasta ebullición dH 2 O volumen para evitar que se desborde de agua, y permitir la completa disolución antes de continuar. </li><li> Agregue los trozos de capullo hasta que hierva dH <sub&gt; 2 O durante 40 min., y usar una barra de teflón recubierto revuelo para agitar capullos durante el proceso de ebullición. </li><li> Después de hervir, escurrir con cuidado DH 2 O en el fregadero y el anillo de extracto de seda a mano para eliminar el exceso de agua. </li><li> Lavar seda extraer tres veces durante 20 min. cada uno en 1 L de H 2 O en un vaso de precipitados de laboratorio, y utilizar una barra de agitación para hacer circular el volumen dentro de vaso de precipitados. </li><li> Después de lavar, el anillo a cabo el extracto de seda a mano y el extracto de seda fibra lugar dentro de una campana química para permitir el secado de una hora 12. período. </li><li> Al día siguiente, pesan las fibras de seda secas, que es típicamente ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Preparar 9,3 solución LiBr M para un 20% w / v de seda. Utilizar siguientes ecuaciones para calcular el peso necesario y volúmenes: <ol class="lalpha"><li> (Peso de la Seda extracto de la etapa 10) x (4) = ___________ ml de solución total de 9,3 M LiBr </li><li> [(807.705) x (volumen de la parte LiBr 11.a)] / 1000 = ___________ g de LiBr para añadir a DH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Añadir peso medido LiBr en un vaso de vidrio de la siguiente volumen de DH 2 O: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (volumen calculado a partir del paso 11.a) = ___________ ml de H 2 S </li></ol></li><li> Verter esta solución en un tamaño adecuado cilindro graduado, y llevar solución hasta el volumen final, calculado en la parte 11.a. </li><li> Coloque el extracto de seda en el vaso y vierta la solución LiBr sobre las fibras de seda que hacen que las fibras de seda están inmersas en la solución LiBr con una espátula de laboratorio. </li><li> Colocar la seda disuelto en 60 ° horno C durante 4 horas: Hora de inicio: ___________ Hora de finalización: ___________ </li><li> Usando una jeringa de tamaño adecuado elaborar 12 ml de la solución de seda. Coloque una aguja 18G en el extremo de la jeringa, y luego inyectar la solución en un casette de diálisis (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Después de llenar la bandeja, sacar el aire que queda fuera de la cinta con la jeringa vacía. </li><li> Lugar ficasete de diálisis lled el plazo de 1 L de H 2 O. </li><li> Cambiar DH 2 de O después de 1 hora, 4 horas, de 8 horas y luego cada 12 horas 3 veces para un total de 6 cambios: <ol class="lalpha"><li> Inicio: ___________ </li><li> 1 hora: ___________ </li><li> 4 horas para situaciones: ___________ </li><li> 8 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> Final: ___________ </li></ol></li><li> Después de la diálisis, lentamente recoger la solución de la seda de cassettes con la jeringa. Coloque la solución en tubos de centrífuga de 10.000 g nominales. </li><li> Centrifugar la solución dos veces a 10.000 ga 4 ° C durante 20-minutos cada uno. Después de cada sobrenadante lugar centrifugación en un tubo nuevo. </li><li> Tienda thr solución de seda en 4 ° C refrigerador. </li><li> Pipeta 2 muestras de 0,5 ml de solución de seda en pequeños pesar la cápsula, y el lugar pesan los platos dentro de un horno a 60 ° C en seco durante 12 horas o hasta que se seque de seda de la solución. </li><li> Pesar la película restante de seda sólido a partir de both muestras para medir solución de seda por ciento en peso de concentración en volumen de proteína: <ol class="lalpha"><li> Peso de la combinación de 2 muestras de cine de seda: ___________ mg </li><li> (Peso de la 23.a) x (100) = seda ___________% </li></ol></li></ol> 3. Preparación de las películas de seda y de instalación de sistema de cultivo <ol><li> Prepare las superficies de PDMS de fundición de una limpieza con cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo. </li><li> Limpieza PDMS sustratos por inmersión en el 70% de etanol y lavar tres veces con dH 2 O. </li><li> Colocar 14 mm moldes PDMS en el plato de soporte, que es típicamente una tapa 24 y placa. </li><li> Para producir una película de 50 micras de espesor, se extendió 70 μls de solución de seda 8% en moldes de PDMS utilizando una herramienta de propagación líquido que es típicamente un 1 ml jeringa con punta 2. </li><li> Permitir las películas de seda para secar cubierto en un banco corriente limpia una presión de flujo de aire de 150 Pa durante un período de 90 minutos o hasta que las películas están secos. </li><li> Una vez que las películas son un lugar seco todo el conjunto de películas, incluyendo PDMS medad, en una cámara de agua-recocido durante más de 4 horas para producir una película insoluble en agua. Esto es típicamente una cámara de vacío desecador con agua en el fondo de la cuenca tiró de un vacío kPa 25 15. </li><li> Quite las películas de seda de agua la cámara de recocido y coloque en una mesa de trabajo limpia. </li><li> Preparar un baño de EtOH 70% en un 35 mm placa de Petri, y sustratos lugar de control (es decir, vidrio o plástico) y anillos de acero inoxidable dentro de los pozos por lo menos durante 10 minutos para esterilizar. </li><li> Quite las películas de seda a partir de moldes de PDMS con fórceps, a sumergirse en EtOH al 70%, y muestra el lugar en placa de 24 pocillos prellenada con 1 ml de EtOH al 70% haciendo que el lado estampado quede hacia arriba para permitir la adhesión celular. </li><li> Después de colocar cada muestra de cine de seda en un lugar así correspondientes inoxidable pesos de acero del anillo (11,65 mm de diámetro interior, 15,45 mm de diámetro exterior y 1,18 mm de espesor) en la parte superior. </li><li> Deje que las muestras con anillos de incubar durante 10 minutos para mantener la esterilidad. </li><li> RemoVe EtOH y lavar cada muestra 3 veces con 1 ml de PBS. Que cada lavado reposar durante 5 min para permitir la difusión completa. </li><li> Retire PBS utilizando una pipeta de aspiración de vidrio, mientras se asegura de eliminar la mayoría de las burbujas por debajo de las muestras de cine de seda. </li><li> Preparar la línea celular para la siembra. Como un ejemplo, trypsinize humano corneal limbal-epitelial (HCLE) línea celular con 0,25% de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para solución de 7-min. Desactivar el uso de la tripsina 01:01 volumen de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), los medios de comunicación de paso con FBS al 10% añadido. Centrifugar las células con tripsina HCLE, añadir 8 ml de queratinocitos medio libre de suero (K-SFM) al pellet de células, agitar suavemente para dispersar HCLEs, y generar el recuento de células. </li><li> Muestra de 500 l de la suspensión HCLE por pozo típicamente usando una de cada 10.000 células / cm 2 de la densidad. </li><li> Coloque las culturas dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 y ejecutar el protocolo que desee experimental. </li></ol> 4. Los resultados representativos &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Figura 1. Flujograma que ilustra resumida proceso de 10 pasos de la producción de seda, el cine y la preparación del sistema de cultivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figura 2. (A) 21-colorante matriz de topografías superficiales estampadas línea producidas sobre una oblea de silicio de 90 mm ​​de diámetro empleando técnicas estándar de grabado fotolitográficas y seco. (B) las películas originales de seda conservan características de la línea en paralelo con dibujos después de la fundición de moldeo en las superficies de PDMS. (C) Esquema mostrando el diseño tamaño de la característica elegida para facilitar la alineación celular. (D) Sección transversal de la película de seda que ilustra retenido superficie paralela alineada con dibujos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías electrónicas de barrido de línea celular HCLE adherirse a (A) con patróny (B) las películas planas de seda en el día 2 en cultivo. Culturas HCLE siguen proliferando en la confluencia de (C) con dibujos y (D) las superficies planas el día 8 en la cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figura 4. (A, D, G) con dibujos y (B, E, H) películas planas de seda de cultivo las células HCLE comparativamente a (C, F, I) sustratos de vidrio de control en (AC) el día 1, (DF) el día 4, y (GI) el día 8 en la cultura. (J) contenido CyQuant ácido nucleico y (K) (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) datos de la actividad metabólica de ensayo que demuestran la viabilidad HCLE tanto en estampado y planas sustratos de película de seda cuando se compara con las superficies de control de vidrio en el tiempo (barras de escala = 100 micras). Video 1. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie de película de estampado de seda durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Video 2. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie plana de control de TCP durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<ol>
	<li>Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Fabrication+from+Bombyx+mori+Silk+Fibroin.">Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin.</a> Nature protocols. , (2011).</li><li>Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+methods+to+control+silk+fibroin+film+biomaterial+features.">Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features.</a> Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).</li><li>Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+biomaterials.">Silk-based biomaterials.</a> Biomaterials. 24, 401-416 (2003).</li><li>Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+fibroin+as+an+organic+polymer+for+controlled+drug+delivery.">Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).</li><li>Demura, M., Asakura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+glucose+oxidase+with+Bombyx+mori+silk+fibroin+by+only+stretching+treatment+and+its+application+to+glucose+sensor.">Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor.</a> Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+silk+protein+biomaterial+systems+for+optical+devices.">Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices.</a> Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).</li><li>Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+responses+to+silk+films+in+vitro+and+in+vivo.">The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 26, 147-155 (2005).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).</li><li>Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+behavior+of+porous+silk+fibroin+sheets.">Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.</a> Biomaterials. 24, 357-365 (2003).</li><li>Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Bombyx+mori+silk+fibroin+fibers+and+films.">Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films.</a> Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).</li><li>Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+biomaterials+for+cornea+tissue+engineering.">Silk film biomaterials for cornea tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).</li><li>Ma, X., Cao, C., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+silk+fibroin+films+containing+sulfonated+silk+fibroin.">The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).</li><li>Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+single-cell+interactions+with+microtopographical+cues.">Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues.</a> Biomedical. , (2010).</li><li>Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Stable+Silk+Films+with+Reduced+&#x03B2;-Sheet+Content.">Water-Stable Silk Films with Reduced &#x03B2;-Sheet Content.</a> Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).</li><li>Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Hydration+on+Silk+Film+Material+Properties.">Effect of Hydration on Silk Film Material Properties.</a> Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+silk+fibroin+as+a+support+for+enzyme+immobilization.">Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization.</a> Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+the+fibroin+of+Bombyx+mori+with+trypsin.">Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin.</a> Biochemical Journal. 93, 45 (1964).</li><li>Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy.">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li><li>Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes+as+potential+substrata+for+epithelial+constructs+used+in+the+management+of+ocular+surface+disorders.">Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).</li><li>Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Silk+Material+Structure+by+Temperature-Controlled+Water+Vapor+Annealing.">Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing.</a> Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).</li><li>Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+route+for+silk.">A new route for silk.</a> Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).</li><li>Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+equivalents+constructed+on+Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes.">Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes.</a> Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).</li><li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+at+a+distance:+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus.">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li><li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El uso de películas de seda regeneradas como un sustrato para el cultivo celular se ha ganado en popularidad en las últimas dos décadas debido a la amplia caracterización de las propiedades de los materiales de esta proteína y mayor comprensión de su utilidad biomaterial 3,8. El sistema de cultivo descrito aquí representa una novela en el sistema de ensayo in vitro para la evaluación de las interacciones de la superficie celular de la seda con dibujos de cine biomaterial sustratos 7. El sistema permite un análisis en profundidad de las interacciones celulares en el tiempo que puede ser fácilmente adoptados para alto rendimiento de recolección de datos. Esto es en gran medida permitido por las películas de seda poseen un número de propiedades sintonizables biomaterial que puede ser modificado para afectar directamente la función celular 8,9,12, incluyendo: control de la superficie de micro / nano topografía de la superficie 7; químicas diferentes de la superficie mediante la modificación covalente o adsorción de moléculas biológicamente activas 13; robusta mechpropiedades anical 15,16, control de material de hidrofilicidad / hidrofobicidad 16, la carga a granel de compuestos biológicos para la liberación de 4,8,17, y de disolución controlada / las tasas de degradación enzimática a través del control de la estructura secundaria (el contenido de la hoja beta) 11,18,19 . La transparencia de las películas de seda se consigue a través de las películas de recocido durante un período de tiempo en vacío en la presencia de vapor de agua 7,15. Este enfoque permite el procesamiento para la formación de la estructura β-lámina secundaria, fomentando la insolubilidad del material en agua al tiempo que permite difracción mínimo de luz 15. Esta transparencia de las películas es clave para permitir directa de imágenes en vivo de células que pueden ser empleados en virtud de una serie de modalidades de imagen (es decir, de gran campo y fluorescencia) con cualquier número de sistemas de microscopio 12,20. Además de imágenes de células vivas-, las películas de seda se puede quitar fácilmente de thsistema de correo para permitir que la cultura para la fijación y análisis adicionales. Así, la gran variedad de directos evaluaciones experimentales que se pueden realizar en este sistema son aplicables a una amplia variedad de fuentes de células / tejidos para muchos ámbitos técnicos 3,8,9,12,13,21. Los resultados de time-lapse de imágenes ilustran cómo en tiempo real los datos del cultivo puede ser recogida, y como ejemplo se utilizaron para ilustrar cómo la topografía de la superficie afecta a las interacciones celulares. Los resultados representativos demostrar cómo biomateriales de seda de película puede ser utilizada para soportar el crecimiento del cultivo HCLE, y son susceptibles de ser un número de proliferación celular estándar y ensayos metabólicos (Fig. 4). Además, los cultivos se fijaron y procesaron para la digitalización de imágenes de electrones u otros protocolos (Fig. 3). Sustratos de seda de la película se produce en el laboratorio con alta fidelidad, consistencia, y con un costo relativamente bajo (fig. 1). Esto permite reproducibilidaddad, tanto en la configuración del sistema cultural y los resultados experimentales. Se ha demostrado que el agua de recocido de procesamiento produce un material de seda película estable dentro de la cultura que ha definido tasas de degradación en espera de la concentración de las proteasas en solución 2,15,22. Como resultado, estos materiales pueden ser utilizados durante largos períodos de tiempo para el cultivo celular a largo plazo, o permanecer implantado durante meses o años, dependiendo de la ubicación fisiológica 8. Además, el trabajo reciente ha demostrado que tanto la estructura de la proteína y las propiedades del material de las películas de seda recocido de agua son consistentes de un lote a otro teniendo en cuenta los resultados del cultivo reproducibles como se muestra a través de diversos métodos de pruebas mecánicas y biofísicas 15,16. Además, la superficie del material ha demostrado una gran fidelidad entre los lotes de películas, como se indica por la SEM, la fuerza atómica micrscopy (AFM), y los estudios de cultivo celular {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Material de la estabilidaddad y la consistencia es un factor importante a la forma en la celda detectará el sustrato de cultivo a través de las vías mecanotransducción diferentes, y, finalmente, producir una respuesta celular deseada / no deseada 25,26. Normas Históricos para sustratos de cultivo, tales como plástico de cultivo de tejidos tratados o de vidrio, proporcionan sustratos adecuados para la fijación celular. Sin embargo, estos materiales no son modificables por utilidad adicional en vivo. Se puede prever que una película de seda biomaterial puede ser personalizado in vitro, y una vez que las expectativas de experimentación se han logrado de la película personalizado puede ser trasladada a un modelo in vivo. Tal diseño emparejamiento entre in vitro y la experimentación in vivo ofrece una gran ventaja para estos biomateriales de seda implantables más de otros sustratos que se utilizan rutinariamente in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Los capullos de seda </td><td> Tajima Shoji Co., LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS monómero y transversal enlazador- </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Carbonato de Sodio </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> De bromuro de litio </td><td> Sigma </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 ml de jeringa </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> Arandela de acero inoxidable </td><td> Lavadora Superior </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24-pocillos </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

Películas de seda son prometedores basados ​​en proteínas biomateriales que pueden ser fabricados con alta fidelidad y rentabilidad en un entorno de laboratorio de investigación 1,2. Estos materiales son deseables debido a que poseen características dimensionales y material altamente controlables, son biocompatibles y promover la adhesión celular, se puede modificar a través de patrón topográfico o por modificación de la superficie, y puede ser utilizado como un depósito para las moléculas biológicamente activas para aplicaciones de suministro de fármacos relacionados 3-8. Además, las películas de seda son relativamente sencillos de diseño personalizado, se pueden diseñar para disolver en cuestión de minutos o se degradan con el año in vitro o in vivo, y se producen con la ventaja añadida de ser transparente en la naturaleza y por lo tanto muy adecuado para aplicaciones de imágenes 9 - 13. La metodología de sistema de cultivo que aquí se presenta representa un enfoque escalable para la evaluación rápida de la superficie de la película de células de sedainteracciones. De particular interés es el uso de películas superficiales de seda estampadas para estudiar las diferencias en la proliferación celular y las respuestas de las células para la alineación 12,14. Los cultivos con semillas fueron cultivadas en tanto micro-patrones y planos sustratos de película de seda, y luego evaluaron a través de contraste de fase time-lapse de imágenes, microscopía electrónica de barrido, y la evaluación bioquímica de la actividad metabólica y contenido de ácido nucleico. En resumen, la película de seda en el sistema de cultivo in vitro ofrece una configuración adaptable experimental adecuado para el estudio de las interacciones de la superficie celular en un sustrato biomaterial, que luego pueden ser optimizadas y luego traducido a modelos in vivo. Las observaciones con el sistema de cultivo que aquí se presenta, actualmente se utilizan para ayudar en aplicaciones que van desde las interacciones celulares básicos para el diseño de dispositivos médicos, y por lo tanto son relevantes para una amplia gama de campos de la biomedicina.

Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Películas de seda son una nueva clase de biomateriales fácilmente personalizables para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. La película presentó seda sistema de cultivo es altamente adaptable a una variedad de<em&gt; In vitro</em&gt; Análisis. Este sistema representa una oferta de diseño de plataforma de biomateriales<em&gt; In vitro</em&gt; Optimización de la traducción directa al<em&gt; En vivo</em&gt; Modelos.

Cine Cultura de la Seda del sistema para In vitro Análisis y Diseño de Biomateriales

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Investigación

Bioingeniería

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Análisis sistemático de<em&gt; In Vitro</em&gt; Celda balanceo Utilizando un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

El diseño de proteínas de seda-seda aleaciones para aplicaciones biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro modelo de cultivo celular para Toxic inhalado Prueba química

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

Diseño y análisis para la simplificación del sistema de detección de caídas

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...