Name: silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

Finansiering från NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 och R01 EY020856 Forskning kring att förebygga blindhet Award karriärrådgivning, och Tri-institutionella Stem Cell Initiative. HCLE cellinje som tillstånd av Dr Ilene Gipson. Författarna vill tacka Dr Aihong Liu vid Weill Cornell Medical College för henne tekniskt bistånd och vägledning med cellodling, Anthony Labissiere på sjukhuset för särskilda operationer för henne tekniskt bistånd med SEM avbildning, för vävnadsteknik Resource Center (TERC) på Tufts University för teknisk support med materialutveckling och Cornell Centrum för nanovetenskap och teknologi (CNF) för assistans vid kiselskivan tillverkning.

1. Tillverkning av silikongummi mögel <ol><li> Producera eller köpa en önskad topografiska yta för gjutning. För denna publikation en standard 100 mm etsat kiselskiva kommer att beskrivas (figur 1). </li><li> Väg upp polydimetylsiloxan (PDMS) ingjutning (komponent A) och katalysator (komponent B) lösning i ett 1:9 förhållande (9 g ingjutning och 1 g katalysator) som föreskrivs i den köpta kit. </li><li> Blanda lösningar noggrant för att initiera härdningsprocessen. </li><li> Placera kiselskiva yta i en gjutning maträtt. </li><li> Väg upp 4,5 g av PDMS-lösning på kiselskivan. </li><li> Spridningen PDMS lösning för att täcka en yta 100 mm: s diameter skivytan. </li><li> Luta wafer att sprida PDMS lösningen jämnt. </li><li> Höljesskivan med 100 mm diameter Petri-skål lock. </li><li> Placera gjutning inställning i 60 ° C ugn över natten, vilket gör säker på att härdningen sker på en plan yta. </li><li> Ställe härdade PDMS / kiselskiva till 70% etanolbad före borttagning. </li><li> Börja ta bort PDMS från rånet med hjälp av rakblad för att lyfta kanten (hela omkrets) först. </li><li> Dra försiktigt PDMS bort med pincett inom en 70% etanol badet var noga med att inte slita silikongummi gjutning. </li><li> Punch Out enskilda PDMS formar med 14 slag mm hål. Denna diameter är utformad för att passa in i en 24-brunnsplatta konfiguration. </li></ol> 2. Produktion av Silk lösning <ol><li> Bringa 2 L destillerat vatten (dHaO 2 O) till kokning inom en glasbägare 7. </li><li> Klipp 5 g Bombyx mori Silkeskokonger i tredjedelar. </li><li> Kasta omfattande förorenade kokonger som indikeras av överdriven insekt partiklar beläggning den inre kokong ytan. </li><li> Mäta 4,24 g natriumkarbonat. </li><li> Tillsätt natriumkarbonat långsamt till kokning dH 2 O volym för att förhindra kokning över vatten, och tillåta fullständig upplösning innan den fortsätter. </li><li> Lägg kokong stycken till kokning dH <sub&gt; 2 O under 40 min., och använda en teflonbelagd omrörarstav omröras silkeskokonger under kokningsprocessen. </li><li> Efter kokning försiktigt rinna dH 2 O i vasken och ring ut siden extraktet genom handen för att ta bort överflödigt vatten. </li><li> Tvätta silke extrahera tre gånger under 20 min. vardera i 1 L av dH 2 O i ett laboratorium bägare, och använda en omrörarstav för att cirkulera volym inuti bägaren. </li><li> Efter tvättning, ring ut siden extraktet genom handen och placera siden fiber extrakt inuti en dragskåp för att möjliggöra för torkning för ett 12 timmar. period. </li><li> Nästa dag, väger de torkade silke fibrerna, vilket är normalt ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Förbered 9,3 M LiBr lösning för en 20% vikt / volym lösning av silke. Utnyttja följande ekvationer för att beräkna nödvändiga vikt och volymer: <ol class="lalpha"><li> (Silke extrakt vikt från steg 10) x (4) = ___________-ml totalt 9,3 M LiBr lösning </li><li> [(807,705) x (LiBr volym från del 11.a)] / 1000 = ___________ g LiBr lägga till dH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Tillsätt mätt LiBr vikt till en glasbägare av följande dH 2 O volym: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (beräknade volymen från steg 11.a) = ___________ ml dH 2 O </li></ol></li><li> Hälla denna lösning till en lämplig storlek mätcylinder, och bringa lösningen till den slutliga volymen som beräknats i del 11.a. </li><li> Placera siden extraktet till bägare och häll LiBr lösning under de siden fibrerna och se till att silke fibrerna är nedsänkta i LiBr med hjälp av en lab spatel. </li><li> Placera den upplösta silke i 60 ° C ugn under 4 timmar: Starttid: ___________ Sluttid: ___________ </li><li> Använda en lämplig storlek spruta upprätta 12 ml av silke lösningen. Placera en 18G nål på änden av sprutan och sedan injicera lösningen i en dialys spelare (3.500 MW coutoff, Slide-A-analysatorn, Thermo Scientific). Efter påfyllning kassetten, dra den återstående luften ur kassetten med den tömda sprutan. </li><li> Placera filled dialys kassett inom 1 liter dH 2 O. </li><li> Ändra dH 2 O volymen efter 1 timme, 4 timmar, 8 timmar och därefter var 12 timmar 3x för totalt 6 förändringar: <ol class="lalpha"><li> Börjar: ___________ </li><li> 1 timme: ___________ </li><li> 4h: ___________ </li><li> 8 h: ___________ </li><li> 12 hr: ___________ </li><li> 12 hr: ___________ </li><li> 12 hr: ___________ </li><li> Slut: ___________ </li></ol></li><li> Efter dialys långsamt samla siden lösningen från kassetter med spruta. Placera lösningen i 10.000 g rankade centrifugrör. </li><li> Centrifugera lösningen två gånger vid 10.000 g vid 4 ° C under 20-minuter vardera. Efter varje centrifugering plats supernatanten till ett nytt rör. </li><li> Store Thr silke lösning i 4 ° C kylskåp. </li><li> Pipettera 2 prover av 0,5 ml silk-lösning i små väger skålen och plats väger rätter i en 60 ° C torr ugn i 12 timmar eller tills silke lösningen torkar. </li><li> Väg kvarvarande fasta siden film från both prov för att mäta silk vikt lösning procent till volym proteinkoncentration: <ol class="lalpha"><li> Vikt av kombinerade 2 prov siden film: ___________ mg </li><li> (Vikt från 23.a) x (100) = ___________% silke </li></ol></li></ol> 3. Beredning av Silk Filmer och kultur System Setup <ol><li> Förbered PDMS gjutning ytor genom rengöring med genomskinlig tejp för att avlägsna damm. </li><li> Ren PDMS substrat genom blötläggning i 70% EtOH och tvätta tre gånger med dH 2 O. </li><li> Ställe 14 mm PDMS formar på hållarplattan, som typiskt är en 24-brunnsplatta lock. </li><li> För att producera en 50 m tjock film, spred 70 xl 8% silke lösning på PDMS formar med hjälp av en vätska sprids verktyg som är typiskt en 1 ml spruta Tips 2. </li><li> Låt silke filmerna för att torka utan täckning på en ren bänk kör en tryck luftflöde på 150 Pa under en period av 90 minuter eller tills filmer är torra. </li><li> När filmer är torrt hel uppsättning filmer, däribland PDMS måldern, i en vatten-glödgning kammare för&gt; 4 h för att producera en vattenolöslig film. Detta är typiskt en tom kammare exsickator med vatten i botten av bassängen drog i en 25 kPa vakuum 15. </li><li> Ta bort siden filmer från vatten-glödgning kammaren och plats på en ren bänk. </li><li> Förbered en 70% EtOH bad inom en 35 mm petriskål och placera substrat kontroll (dvs glas eller plast ytor) och rostfritt stål ringar i brunnarna minst 10 min för att sterilisera. </li><li> Ta bort siden filmer från PDMS formar med hjälp av pincett, doppa dem i 70% EtOH, och placera provet i 24-brunnar förifyllda med 1 ml 70% EtOH och se mönstrade sidan är vänd uppåt för att möjliggöra celladhesion. </li><li> Efter placering av varje prov silke filmen in i en motsvarande och placera rostfritt vikter stålring (11,65 mm innerdiameter, 15,45 mm ytterdiameter och 1,18 mm tjocklek) på toppen. </li><li> Tillåta prover med ringar för att inkubera under 10 minuter för att säkerställa sterilitet. </li><li> Remove EtOH och tvätta varje prov 3x med 1 ml PBS. Låta varje tvättning sitta under 5 min för att medge fullständig diffusion. </li><li> Ta bort PBS med aspirerande glaspipett, och samtidigt se till att ta bort huvuddelen av bubblor under prover siden film. </li><li> Förbereda cellinje för ympning. Som ett exempel, Trypsinisera humant korneal-limbala epitelial (HCLE) cellinje med 0,25% trypsin och etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för 7-min. Deaktivera trypsin med användning av 1:1 volym av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) passage medium med 10% FBS tillsattes. Centrifugera trypsinerade HCLE celler, tillsätt 8-ml keratinocyt-serumfritt media (K-SFM) till cellpelleten, skaka försiktigt för att skingra HCLEs, och generera celltal. </li><li> Exempel på 500 pl HCLE suspension per brunn normalt med hjälp av en 10.000 celler / cm 2 densitet. </li><li> Ställe kulturer inom inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 och kördes önskade försöksprotokoll. </li></ol> 4. Representativa resultat &lt;p klass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Figur 1. Flödesschema som illustrerar sammanfattad 10-stegs process av silke filmproduktion och kultur systemet beredning. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figur 2. (A) 21-färgämne samling av mönstrade kretsmönster line ytan produceras på en 90 mm ​​diameter kiselskiva användning av standardmetoder fotolitografiska och torretsning tekniker. (B) Silk filmer behåller original parallell linje mönstrade funktioner efter gjutning på PDMS gjutning ytor. (C) Schematisk visar karaktäristisk utformning som valts för att främja cellulär anpassning. (D) Tvärsnitt av siden filmen illustrerar kvar parallellt kantad mönstrad yta. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figur 3. Svepelektronmikrofotografier av HCLE cellinje vidhäftar (A) mönstratoch (B) platta siden filmer på dag 2 i kultur. HCLE kulturer fortsätter att proliferera till konfluens på (C) mönstrad och (D) platta ytor på dag 8 i odling. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figur 4. (A, D, G) Mönstrad och (B, E, H) platta filmer silkesodling HCLE celler relativt till (C, F, I) glas kontroll substrat på (AC) dag 1, (DF) Dag 4, och (GI) dag 8 i odling. (J) CyQUANT nukleinsyra innehåll och (K) (3 - (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) metabolisk aktivitet analysdata visar HCLE viabilitet på både mönstrade och plana silke substrat film jämfört med glasytor kontroll över tid (Skalstrecken = 100 nm). Video 1. Time lapse faskontrast avbildning av HCLE celler som migrerar över en mönstrad siden filmytan under en 18 timmar. tidsperiod. Celler såddes vid 10k/cm 2 densitet och odlades under 2 h. tidigare bilder. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Klicka här för att se filmen</a> . Video 2. Time lapse faskontrast avbildning av HCLE celler som migrerar över en plan TCP kontroll ytan under en 18 timmar. tidsperiod. Celler såddes vid 10k/cm 2 densitet och odlades under 2 timmar. tidigare bilder. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Klicka här för att se filmen</a> .

<ol>
	<li>Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+Fabrication+from+Bombyx+mori+Silk+Fibroin.">Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin.</a> Nature protocols. , (2011).</li><li>Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+methods+to+control+silk+fibroin+film+biomaterial+features.">Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features.</a> Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).</li><li>Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+biomaterials.">Silk-based biomaterials.</a> Biomaterials. 24, 401-416 (2003).</li><li>Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+fibroin+as+an+organic+polymer+for+controlled+drug+delivery.">Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).</li><li>Demura, M., Asakura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+glucose+oxidase+with+Bombyx+mori+silk+fibroin+by+only+stretching+treatment+and+its+application+to+glucose+sensor.">Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor.</a> Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+silk+protein+biomaterial+systems+for+optical+devices.">Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices.</a> Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).</li><li>Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+responses+to+silk+films+in+vitro+and+in+vivo.">The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 26, 147-155 (2005).</li><li>Vepari, C., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+as+a+biomaterial.">Silk as a biomaterial.</a> Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).</li><li>Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+behavior+of+porous+silk+fibroin+sheets.">Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.</a> Biomaterials. 24, 357-365 (2003).</li><li>Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+Bombyx+mori+silk+fibroin+fibers+and+films.">Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films.</a> Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).</li><li>Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk+film+biomaterials+for+cornea+tissue+engineering.">Silk film biomaterials for cornea tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).</li><li>Ma, X., Cao, C., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+silk+fibroin+films+containing+sulfonated+silk+fibroin.">The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).</li><li>Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+single-cell+interactions+with+microtopographical+cues.">Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues.</a> Biomedical. , (2010).</li><li>Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Stable+Silk+Films+with+Reduced+&#x03B2;-Sheet+Content.">Water-Stable Silk Films with Reduced &#x03B2;-Sheet Content.</a> Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).</li><li>Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Hydration+on+Silk+Film+Material+Properties.">Effect of Hydration on Silk Film Material Properties.</a> Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+silk+fibroin+as+a+support+for+enzyme+immobilization.">Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization.</a> Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).</li><li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals.">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li><li>Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+the+fibroin+of+Bombyx+mori+with+trypsin.">Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin.</a> Biochemical Journal. 93, 45 (1964).</li><li>Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy.">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li><li>Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes+as+potential+substrata+for+epithelial+constructs+used+in+the+management+of+ocular+surface+disorders.">Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).</li><li>Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Silk+Material+Structure+by+Temperature-Controlled+Water+Vapor+Annealing.">Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing.</a> Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).</li><li>Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+route+for+silk.">A new route for silk.</a> Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).</li><li>Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+corneal+epithelial+equivalents+constructed+on+Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes.">Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes.</a> Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).</li><li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+at+a+distance:+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus.">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li><li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Användningen av regenererad siden filmer som substrat för cellodling har vunnit i popularitet under de senaste två decennierna på grund av omfattande karakterisering av materialegenskaper av detta protein och ökad förståelse av dess biomaterial användbarhet 3,8. Kulturen som beskrivs här är en ny in vitro-testsystem för att bedöma interaktioner cellytan på mönstrade siden filmen biomaterial substrat 7. Systemet gör det möjligt för en fördjupad analys av cellulära interaktioner över tiden som lätt kan antas för hög genomströmning datainsamling. Detta är till stor del aktiverat eftersom siden filmer har ett antal avstämbara biomaterial egenskaper som kan modifieras för att direkt påverka cellfunktionen 8,9,12, inklusive: kontroll av ytan mikro / nano-ytans topografi 7, olika ytor kemiska genom kovalent modifiering eller adsorption av biologiskt aktiva molekyler 13; robust mekanical fastigheter 15,16, kontroll av material hydrofilitet / hydrofobicitet 16, delen lastning av biologiska föreningar för frisläppande 4,8,17, och kontrollerad upplösning / enzymatiska priser nedbrytning genom kontroll av den sekundära strukturen (beta ark innehåll) 11,18,19 . Insynen i siden filmer uppnås genom glödgning filmerna under en tid under vakuum i närvaro av vattenånga 7,15. Denna behandling tillvägagångssätt medger bildning av β ark sekundär struktur, befrämjade olöslighet av materialet i vatten samtidigt som minimal diffraktion av ljus 15. Denna öppenhet filmer är nyckeln för att direkt levande cell imaging som kan användas under ett antal avbildningsmetoder (dvs. brett fält och fluorescens) med valfritt antal mikroskop system 12,20. Förutom live-cell imaging, kan silke filmer lätt tas bort från ee kultur för att möjliggöra ytterligare fixering och analys. Således, den stora variation av direkta experimentella bedömningar som kan utföras på detta system är tillämpliga på en mängd olika celler / vävnader källor för många tekniska områden 3,8,9,12,13,21. De tidsförlopp avbildande resultat illustrerar hur realtid kultur data kan samlas in, och som ett exempel användes för att illustrera hur yttopografi påverkar cell-interaktioner. De representativa resultat visar hur silke film biomaterial kan användas för att stödja HCLE kulturtillväxt och är kan ändras på ett antal standard cellulär proliferation och metaboliska analyser (fig. 4). Dessutom är de kulturer fixerades och bearbetades för svepelektron avbildning eller andra protokoll (fig. 3). Silk film substrat produceras i labbet med hög trohet, konsekvens och med relativt låg kostnad (Fig. 1). Detta möjliggör reproduciansvar för både kultur systeminstallation och experimentella resultat. Det har visats att vatten-glödgning bearbetning ger ett stabilt material silk filmen inom kultur som har definierat förstöras i väntan på koncentrationen av proteaser i lösning 2,15,22. Som ett resultat av dessa material får användas under en längre tid för långsiktig cellodling, eller förblir implanteras i månader eller år beroende på den fysiologiska plats 8. Dessutom har senare arbete visat att både proteinet struktur och materialegenskaper av vatten-glödgad silke filmer är konsekvent från parti till parti möjliggör reproducerbara kultur resultaten som visas genom olika mekaniska och biofysiska testmetoder 15,16. Dessutom har materialets yta visat stor trohet mellan film partier som indikeras av SEM, Atomic Force micrscopy (AFM) och cellkulturstudier {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Materialet stabiltet och konsistens är en viktig faktor för hur cellen kommer att avkänna odlingssubstratet genom de olika mechanotransduction vägar, och slutligen producera en önskad / oönskad cellulär respons 25,26. Historiskt sett för odlingssubstrat, såsom vävnad som behandlas kultur plast eller glas, tillhandahålla adekvata substrat för cellvidhäftning. Emellertid är dessa material inte kan ändras för att ytterligare användbarhet in vivo. Det kan tänkas att en silk film biomaterial kan anpassas in vitro, och när experimentella förväntningar har uppnått anpassade filmen direkt kan översättas till en in vivo-modell. Sådan parade utformning mellan in vitro och in vivo experiment har en stor fördel för sådana implanterbara siden biomaterial över andra substrat som rutinmässigt används in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materialet Namn </td><td> Företaget </td><td> Katalognr </td></tr><tr><td> Silk kokonger </td><td> Tajima Shoji Co, LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS monomer och tvärbindare </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Natriumkarbonat </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> Litiumbromid </td><td> Sigma </td><td> 213.225 </td></tr><tr><td> Slide-A-analysatorn </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66.110 </td></tr><tr><td> 1 ml spruta </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309.602 </td></tr><tr><td> Rostfritt stål bricka </td><td> Överlägsen Bricka </td><td> 81.610 </td></tr><tr><td> 24-brunnars platta </td><td> VWR </td><td> 353.047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

Silk filmer är lovande protein-baserade biomaterial som kan tillverkas med hög trohet och ekonomiskt inom ett forskningsområde laboratoriemiljö 1,2. Dessa material är önskvärda eftersom de besitter mycket kontrollerbar dimensionella och materialegenskaper, är biokompatibla och främja celladhesion, kan modifieras genom topografisk mönstring eller genom att kemiskt förändra ytan, och kan användas som en depå för biologiskt aktiva molekyler för närbesläktade läkemedelsavgivningssystem tillämpningar 3-8. Dessutom, silke filmer är relativt enkelt att skräddarsy, kan utformas för att upplösas inom minuter eller brytas ned med år in vitro eller in vivo, och är producera med den ytterligare fördelen av att vara transparent i naturen och är därför mycket lämplig för avbildningstillämpningar 9 - 13. Kulturen Systemet metoder som presenteras här är en skalbar metod för snabba bedömningar av cell-siden filmytaninteraktioner. Av särskilt intresse är användningen av ytan mönstrade siden filmer att studera skillnader i cell proliferation och svar från celler för anpassning 12,14. De seedade kulturerna odlades på både mikro-mönstrade och platta siden substrat film, och sedan bedömas genom time-lapse faskontrast avbildning, svepelektronmikroskopi, och biokemisk bedömning av metabolisk aktivitet och nukleinsyra innehåll. Sammanfattningsvis erbjuder silke filmen in vitro-odlingssystem en anpassningsbar experimentuppställning lämplig för studier av cellyts-växelverkningar på ett biomaterial substrat, som sedan kan optimeras och översätts sedan till in vivo-modeller. Observationer med hjälp av odlingssystemet som presenteras här används för närvarande för att hjälpa i allt från grundläggande cell interaktioner till medicinsk enhet design, och därmed är relevanta för ett brett spektrum av biomedicinska områden.

Watch this Scientific Journal Video about Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design at JoVE.com

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silke filmer är en ny klass av biomaterial lätt anpassningsbara för en uppsättning av biomedicinska tillämpningar. Den presenterade siden filmkultur systemet är mycket anpassningsbart till olika<em&gt; In vitro</em&gt; Analyser. Detta system innebär en biomaterial erbjudande design plattform<em&gt; In vitro</em&gt; Optimering innan direkt översättning till<em&gt; In vivo</em&gt; Modeller.

Silk Film Kultur System för In vitro Analys och Biomaterial design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

En metod för äggblåsa Inkapsling och kultur i ett Proteolytically Nedbrytbara 3 dimensionellt system

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Självrapporterings Ställningar för 3-dimensionell cellodling

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

Systematisk analys av<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Rolling Med hjälp av en platta med flera brunnar mikroflödessystem

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Designa Silk-silkesprotein Alloy Material för biomedicinska tillämpningar

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cellodling in vitro modell för Toxic Inhalerat Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatiserad robot vätskehantering montering av modulära DNA enheter

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Zebrafiskar Embryo modell för In Vivo visualisering och Intravital analys av Biomaterial-associerade Staphylococcus aureus infektion

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

Design och analys för falldetekteringssystem Förenkling

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...