Name: vampiric isolation of extracellular fluid from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00
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Wir möchten den kooperativen Charakter der Hunter-Labor bestätigen, und danke ihnen für die hilfreiche Diskussionen und Unterstützung, die Entwicklung dieser Technik möglich und Spaß gemacht. Wir möchten Nigel Delaney und Caenorhabditis Genetics Center for Wurm und Bakterienstämme danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health GM089795 Zuschuss CPH unterstützt.

Ein. Herstellung von Materialien Das Material notwendig vampirischen umgekehrter Mikroinjektion ist ähnlich dem für Standard Mikroinjektion Techniken verwendet, um transgene C. machen erforderlich elegans-Stämme ein. Obwohl einige Reagenzien (z. B. Assay-Platten) hergestellt werden der Tag der experimentellen Übertragung muss viele der Materialien koordinativ über einen 8 Tagen (siehe Tabelle 1 für eine Zeit-Tabelle) hergestellt werden. Als s...

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	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans.">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li><li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations.">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li><li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium.">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li><li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans.">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li><li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mec-3,+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans.">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li><li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1.">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li></ol>

Wir haben hier ein neuartiges Verfahren, das die Isolierung und Charakterisierung der extrazellulären Flüssigkeit von der ermöglicht Modellorganismus C. vorgestellt elegans. Die Technik beginnt mit der genetischen oder physikalische Manipulation von Spender Würmer ihr Gesamtvolumen der extrazellulären Flüssigkeit zu erhöhen. Extrazellulären Flüssigkeit wird dann isoliert unter Verwendung eines modifizierten Mikroinjektionstechnik. Die Würmer sind für die Mikroinjektion mit trockener Agarose-...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Day</strong</td&gt;<td<strong&gt; Worm Prep</strong</td&gt;<td<strong&gt; Material Prep</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 Oder Standes</td&gt;<td&gt; Pflegen sauber, gut gefüttert<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; N2 und Würmern</td&gt;<td&gt; Make Injektion Pads, NGM-Platten, NGM + Carb / IPTG Platten, OP50 LB Lager</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Streak von RNAi Essen auf LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Impfen 3 mL Übernachtung mit RNAi Lebensmitteln</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Bewegen Embryonen RNAi Platte</td&gt;<td&gt; Seed RNAi Platte</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Umschalttaste Würmern bis 25 für 4 Stunden</td&gt;<td&gt; Make Testplatten</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Bewegen Würmer NGM-Platten reinigen</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric Transfer</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Wiederherstellen Empfänger</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Entfernen Übertragungsbehältnis</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +2</td&gt;<td&gt; Score Progeny</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabelle 1.</strong&gt; Material Vorbereitung Timeline.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Ausrüstung</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picoliter Druck Injector</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung</td&gt;<td&gt; Sutter Instruments</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reagenzien</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mineral Oil</td&gt;<td&gt; EM Science</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 no 1 ½ Deckglas</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE Agarose</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borosilikatglas Kapillaren</td&gt;<td&gt; World Precisions Instruments</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumhypochlorit-Lösung (5% verfügbares Chlor)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; Und Bakterienstämme</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi-Vektor<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Source Bioscience (Ahringer Feeding Library)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; PAL-1</em&gt; RNAi-Vektor<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabelle 2.</strong&gt; Spezifische Reagenzien und Geräte.</p

vampiric isolation of extracellular fluid from caenorhabditis elegans

Die genetisch gefügig Modellorganismus C. elegans hat Einblicke in eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen vorgesehen, aktiviert durch seine kurze Generationszeit, einfache Wachstum und geringe Größe. Diese geringe Größe, aber hat lehnten eine Reihe von technischen Ansätzen in anderen Modellsystemen gefunden. Zum Beispiel ermöglichen Bluttransfusionen in Säugetier-Systemen und Transplantation Techniken in Anlagen Fragen des Kreislaufsystems Zusammensetzung und Signalisierung. Das Kreislaufsystem der Schnecke, der pseudocoelom, war bis vor kurzem nicht möglich direkt Assay. Um Fragen der interzellulären Signaltransduktion und Kreislaufsystem Zusammensetzung C. beantworten elegans Forscher haben traditionell genetische Analyse, Zelle / Gewebe-spezifische Rettung und Mosaik-Analyse eingeschaltet. Diese Techniken stellen ein Mittel zu folgern, was zwischen Zellen geschieht, sind jedoch nicht universell in Identifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Moleküle. Hier präsentieren wir eine neWLY entwickelten Technik direkt Assay die pseudocoelomic Flüssigkeit C. elegans. Die Technik beginnt entweder genetisch oder physikalische Manipulation um das Volumen des extrazellulären Fluids zu erhöhen. Danach werden die Tiere mit einem vampirischen umgekehrter Mikroinjektionstechnik mit einer Mikroinjektion rig, die feine Balance Druckregelung ermöglicht unterzogen. Nach Isolierung der extrazellulären Flüssigkeit, kann die aufgefangene Flüssigkeit durch Überführung in anderen Tieren oder durch molekulare Methoden untersucht werden. Um die Wirksamkeit dieser Technik zu demonstrieren wir eine detaillierte Konzept für Assay ein spezifisches Beispiel der extrazellulären Signalmolekülen, lange dsRNA während einer systemischen RNAi-Antwort. Obwohl Charakterisierung der systemischen RNAi ist ein proof of principle Beispiel sehen wir diese Technik als anpassungsfähig an eine Vielzahl von Fragen des Kreislaufsystems Zusammensetzung und Signalisierung beantworten.

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Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE

Die Modell-Organismus<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendet pseudocoelomic Fluid als passives Kreislaufsystems. Direkter Assay dieser Flüssigkeit wurde zuvor nicht möglich. Hier präsentieren wir eine neuartige Technik direkt Assay den extrazellulären Raum, und verwenden systemischen Silencing-Signale während einer RNAi-Antwort als proof of principle Beispiel.

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Research

JoVE Journal

Biology

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