Name: vampiric isolation of extracellular fluid from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi vill tacka för det samarbete natur Hunter Lab, och tacka dem för den hjälpsamma diskussioner och hjälp som gjorde utvecklingen av denna teknik är möjligt och roligt. Vi vill tacka Nigel Delaney och Caenorhabditis genetik Centrum för masken och bakteriestammar. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health GM089795 bidrag till CPH.

1. Beredning av material Uppgifter som är nödvändiga för vampyriska omvänd mikroinjektion liknar den som krävs för vanliga mikroinjektion tekniker som används för att göra transgena C. elegans stammarna 1. Även om vissa reagenser (t.ex. testplattor) görs dagen för experimentell överföring måste många av materialen samordnat tillagas över 8 dagar (se tabell 1 för en tid tabell). Som sådan är det viktigt att planera noggrant när du anvä...

<ol>
	<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection.">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li><li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans.">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li><li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations.">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li><li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium.">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li><li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans.">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li><li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants.">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li><li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mec-3,+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans.">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li><li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1.">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li></ol>

Vi har presenterat här en ny metod som möjliggör isolering och karakterisering av extracellulär vätska från modellorganism C. elegans. Tekniken börjar med genetisk eller fysisk manipulation av donator maskar att öka sin totala volymen av extracellulär vätska. Extracellulär vätska isoleras sedan med hjälp av en modifierad mikroinjektion teknik. Masken är monterade för mikroinjektion med torra agaros kuddar att hålla maskar fortfarande under förfarandet. Den fysiska fastsättning på plattan anv?...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Dag</strong</td&gt;<td<strong&gt; Worm Prep</strong</td&gt;<td<strong&gt; Material Prep</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 Eller tidigare</td&gt;<td&gt; Håll rent, väl utfodrade<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; Och N2 maskar</td&gt;<td&gt; Gör injektion kuddar, NGM tallrikar, NGM + Carb / IPTG plattor, OP50 LB lager</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Streak ut RNAi mat på LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Inokulera 3 ml över natten med RNAi mat</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Flytta embryon till RNAi platta</td&gt;<td&gt; Seed RNAi platta</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Flytta maskar till 25 för 4 timmar</td&gt;<td&gt; Gör testplattor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Flytta maskar för att rengöra NGM plattor</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric överföring</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Recover mottagare</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Ta bort överföring mottagare</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2</td&gt;<td&gt; Score Avkomma</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabell 1.</strong&gt; Material förberedelse tidslinje.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Utrustning</strong</td&gt;<td<strong&gt; Företag</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalognummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picoliter Tryck Injector</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown mikropipett Puller</td&gt;<td&gt; Sutter Instrument</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reagens</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mineralolja</td&gt;<td&gt; EM Science</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 nr 1 ½ skyddsglas</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE Agarose</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50.004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borosilicate glaskapillärer</td&gt;<td&gt; World Preciseringar Instrument</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumhypokloritlösning (5% tillgängligt klor)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; Och bakteriestammar</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Den Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi vektor<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Källa Bioscience (Ahringer matning Library)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; PAL-1</em&gt; RNAi vektor<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Den Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabell 2.</strong&gt; Specifika reagens och utrustning.</p

vampiric isolation of extracellular fluid from caenorhabditis elegans

Den genetiskt lätthanterlig modellorganism C. elegans har gett insikt i en myriad av biologiska frågor, aktiveras av sin korta generationstid, enkel tillväxt och liten storlek. Den lilla storleken, men har förbjudit ett antal tekniska metoder finns i andra modellsystem. Till exempel möjliggör blodtransfusioner i däggdjur system och ympning teknik i växter ställa frågor cirkulationssystemet sammansättning och signalering. Cirkulationssystemet hos masken, det pseudocoelom, har tills nyligen varit omöjligt att direkt analys. Att svara på frågor om intercellulär signalering och cirkulationssystemet sammansättning C. elegans forskare har traditionellt vänt sig till genetisk analys, celler / vävnader specifik räddning och mosaik analys. Dessa tekniker ger ett medel för att sluta sig vad som händer mellan celler, men är inte allmänt tillämpliga vid identifiering och karakterisering av extracellulära molekyler. Här presenterar vi en newly utvecklad teknik för att direkt analysera vätskan pseudocoelomic av C. elegans. Tekniken börjar med antingen genetisk eller fysisk manipulation för att öka volymen av extracellulär vätska. Efteråt djuren utsätts för en vampyriska omvänd mikroinjektion teknik med hjälp av en mikroinjektion rigg som gör finjustering balans tryck. Efter isolering av extracellulär vätska, kan den uppsamlade vätskan analyseras genom överföring till andra djur eller genom molekylära medel. För att demonstrera effektiviteten av denna teknik presenterar vi en detaljerad strategi för att analysera ett specifikt exempel på extracellulära signalmolekyler, lång dsRNA under en systemisk RNAi svar. Även karakterisering av systemisk RNAi är ett bevis på principen exempel ser vi denna teknik som anpassas för att svara på en rad olika frågor om cirkulationssystemet sammansättning och signalering.

Watch this Scientific Journal Video about Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Modellen organismen<em&gt; C. elegans</em&gt; Använder pseudocoelomic vätska som en passiv cirkulationssystemet. Direkt analys av denna vätska har inte varit möjligt tidigare. Här presenterar vi en ny teknik för att direkt analysera extracellulära utrymmet, och använda systemiska tystande signaler under en RNAi svar som ett bevis på principiellt exempel.

Vampyriska Isolering av extracellulär vätska från<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på fasta medier

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Kvantifiering av vävnadsspecifik proteostatisk nedgång i caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellering Åldersassocierade neurodegenerativa sjukdomar i Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...