Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

نشكر أعضاء المختبر لإجراء مناقشات مفيدة ألتو. ونشكر أيضا مرفق التصوير الجزيئي والخلوي في UT الطبية مركز جنوب غرب، وتحديدا الدكتور كريس غيلبين، Januszewski توم، ومولر لوري للحصول على الخبرة الفنية والمشورة. نشكر أيضا الدكتور دونغ Xionan لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI083359 لNMA

1. خلية الثدييات الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجرذ العادي الكلى (NRK)، خلد سرطان عنق الرحم (هيلا)، أو غيرها من الثدييات مناسبا خطوط الخلايا المستزرعة وعند 37 ° C، 5٪ CO 2، على coverslips الزجاج photoetched الشبكية اضافته للعيش الأطباق الخلية (انظر <st...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

طريقة المقدمة هنا يمكن تسليم مباشرة من البروتينات النقية، الأحماض النووية، أو جزيئات صغيرة حقيقية النواة إلى السيتوبلازم ويتيح فائقة عالية الدقة من خلال تحليل العلاقة من المجهر الفلورسنت والإلكترونات. استخدام هذا الأسلوب هو بسيطة لكنها قوية ويمكن القيام بها في ال?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Photoetched ساترة واللوحة لايف خلايا </td><td> ماتيك </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> تكساس الأحمر </td><td> إينفيتروجن </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> سلسلة الأزرق </td><td> إينفيتروجن </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> رودامين وصفها كيت </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0،22 ميكرون وحدة الترشيح الطرد المركزي </td><td> ميليبور </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> الماصات الزجاج البورسليكات </td><td> سوتر الآلات </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette بولير </td><td> سوتر الآلات </td><td> نموذج P-97 </td><td> استخدام برنامج رقم 4 بعد أداء الاختبار المنحدر </td></tr><tr><td> FemtoJet حقن مكروي النظام </td><td> إيبندورف </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> ساترة إزالة السوائل </td><td> ماتيك </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai مجهر إلكترون ناقل </td><td> الاتحاد الدولي للفروسية </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> لايكا </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

الخلية حقيقية النواة تعتمد على التعقيد، درجة عالية من التنظيم، ومقصورات غشاء متميزة وظيفيا المنضم الذي الحفاظ على الاستقطاب البيوكيميائية اللازمة لوظيفة الخلوية المناسبة. فهم كيفية الانزيمات والبروتينات، ومكونات هيكل الخلية والحفاظ على هذا الحكم الفصل البيوكيميائية لذلك من أهمية قصوى. استخدام جزيئات الموسومة fluorescently في توطين و / أو حجرات التحت خلوية التشويش قد حقق ثروة من المعرفة وتقدم فهمنا لتنظيم الخلوية. تقنيات التصوير مثل المجهر الفلورسنت ومبائر جعل التحقق من موقف جزيء صغير الموسومة fluorescently مباشرة نسبيا، ومع ذلك يقتصر القرار هياكل صغيرة جدا 1. من ناحية أخرى، كشف المجهر الإلكتروني تفاصيل التشكل التحت خلوية بدقة عالية جدا، ولكن طبيعته ثابتة يجعل من الصعب قياس ديناميكية للغاية بروcesses بدقة 2،3. وبالتالي، فإن الجمع بين المجهر الضوئي المجهر الإلكتروني مع لنفس العينة، ضوء مترابط ويسمى المجهر الإلكتروني (CLEM) 4،5، يتيح مزايا التصوير فائق السرعة المزدوجة من الفلورسنت مع قرار عالية من المجهر الإلكتروني 6. وقد تم تنفيذ هذه التقنية قوية لدراسة العديد من جوانب بيولوجيا الخلية 5،7. منذ نشأتها، وقد زاد هذا الإجراء قدرتنا على التمييز بين الأشكال التضاريسية وأبنية التحت خلوية بدقة عالية. هنا، نقدم طريقة مبسطة لأداء حقن مكروي السريع تليها CLEM (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا الإجراء حقن مكروي CLEM لإدخال كميات محددة من جزيئات صغيرة و / أو البروتينات مباشرة في السيتوبلازم الخلية حقيقية النواة ودراسة آثار من المليمتر لموضوع القرار نانومتر (الشكل 2). ويستند هذا الأسلوب على microinjectingالخلايا المزروعة في coverslips الزجاج المحفور بالليزر الشبكية الملصقة على الجزء السفلي من الخلية الحية والأطباق التصوير المجهري متحد البؤر مع كل من الفلورسنت والإلكترونات. ومما يسهل توطين الخلية (ق) من الفائدة من جانب نمط الشبكة، والتي يمكن نقلها بسهولة، جنبا إلى جنب مع خلايا الفائدة، إلى الراتنج EPON تستخدم لتجميد العينات وتقطيع قبل تحليل المجهر الإلكتروني (الشكل 3). تراكب الصور من الفلورسنت وEM يسمح للمستخدم لتحديد توطين التحت خلوية، فضلا عن أي تغيرات شكلية و / أو التركيبية الناجمة عن جزيء microinjected من الفائدة (الشكل 4). هذه التقنية هي قابلة للنقاط زمنية تتراوح بين 5 ق ≤ تصل إلى عدة ساعات، وهذا يتوقف على طبيعة العينة microinjected.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

وقد تم تكييف هذه التقنية لتحليل مورفولوجيا CLEM التركيبية للأغشية، العضيات، والهياكل المتضررة من الجزيئات التحت خلوية microinjected. هذا الأسلوب يجمع بين تقنيات قوية من المجهرية / حقن مكروي، المجهري متحد البؤر الفلورسنت، والمجهر الإلكتروني للسماح للقرار نانومتر ملليمتر متعددة. هذه التقنية هي قابلة للطائفة واسعة من التطبيقات.

ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

متلازم متحد البؤر و3D المجهر الإلكتروني لخلية حسية معينة

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي بواسطة المجهر الإلكتروني الضوئي المترابط في المقطع

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...