Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Wij danken de leden van de Alto laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook de moleculaire en cellulaire beeldvorming Facility aan de UT Southwestern Medical Center, in het bijzonder Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, en Laurie Mueller voor technische expertise en advies. We danken ook Dr Xionan Dong voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​AI083359 naar NMA

1. Mammalian Cell Culture <ol><li> Normale Rat Kidney (NRK), onsterfelijk baarmoederhalskanker (HeLa) of andere geschikte zoogdiercellijnen worden gekweekt bij 37 ° C, 5% CO2 op Photoetched glazen dekglaasjes grid aangebracht cel schotels leven (zie tabel 1 voor reagens of inrichting in dit protocol) in DMEM + 10% FBS en 1% Pen / Strep. Er dienen voorzorgsmaatregelen te worden genomen om een ​​steriele omgeving te houden bij het werken met gekweekte zoogdiercellen. </li><li> Let op exp...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

Werkwijze hier gepresenteerde maakt de directe levering van gezuiverde eiwitten, nucleïnezuren of kleine moleculen van de eukaryote cytoplasma en biedt ultrahoge resolutie analyse door de correlatie van fluorescerende en elektronenmicroscopie. Het gebruik van deze methode is eenvoudig maar toch robuust en kan worden uitgevoerd in eigen huis met veel bestaande kern faciliteiten en / of op de juiste wijze voorzien van elektronenmicroscopie labs. De techniek is ontvankelijk voor levende cellen, zodat de gebruiker de dynam...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Photoetched Coverslip en Live-cell Plate </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blue </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 urn centrifugale filtereenheid </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas Pipetten </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipet Puller </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> Model P-97 </td><td> Gebruik programma # 4 na het uitvoeren van ramp-test </td></tr><tr><td> FemtoJet Micro-injectie-systeem </td><td> Eppendorf </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasje verwijderen Fluid </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmissie Elektronen Microscoop </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

De eukaryote cel steunt op complexe, sterk gereguleerd en functioneel verschillende membraan gebonden compartimenten die een biochemische polariteit noodzakelijk te bewaren voor een goede cellulaire functie. Begrijpen hoe de enzymen, eiwitten, en het cytoskelet componenten besturen en onderhouden van deze biochemische scheiding is dan ook van het grootste belang. Het gebruik van fluorescent gelabeld moleculen te lokaliseren en / of verstoren subcellulaire compartimenten heeft een schat aan kennis en ons begrip van cellulaire regelgeving. Beeldvormingstechnieken zoals fluorescente confocale microscopie en maakt bepaling van de positie van een fluorescent gelabeld kleine molecule relatief eenvoudig, is echter de resolutie van zeer kleine beperkt 1. Anderzijds heeft elektronenmicroscopie details bekend van subcellulaire morfologie bij zeer hoge resolutie, maar de statische aard is het moeilijk te meten zeer dynamische proprocessen met precisie 2,3. Dus de combinatie van lichtmicroscopie met elektronenmicroscopie van hetzelfde monster, genoemd Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) 4,5, biedt de dubbele voordelen van ultrasnelle fluorescente beeldvorming met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie 6. Deze krachtige techniek is geïmplementeerd om vele aspecten van celbiologie 5,7 bestuderen. Sinds haar oprichting heeft deze procedure vergroot ons vermogen om subcellulaire architecturen en morfologie met een hoge resolutie te onderscheiden. Hier geven we een gestroomlijnde werkwijze voor het uitvoeren snel gevolgd door micro-injectie CLEM (Fig. 1). De microinjectie CLEM procedure kan worden gebruikt om bepaalde hoeveelheden kleine moleculen en / of eiwitten rechtstreeks in de eukaryote cel cytoplasma en onderzoeken de effecten van millimeter tot meerdere nanometer resolutie (Fig. 2). De techniek is gebaseerd op microinjectingcellen gekweekt op laser geëtst glas gerasterde dekglaasjes aan de onderkant van levende cellen gerechten en imaging zowel confocale fluorescente en elektronenmicroscopie. Lokalisatie van de cel (len) plaats wordt vergemakkelijkt door het rasterpatroon, dat gemakkelijk wordt, overgebracht samen met de cellen van belang, de EPON hars gebruikt voor immobilisatie van monsters en snijden voor elektronenmicroscopie analyse (Fig. 3). Overlay van fluorescerende en EM foto laat de gebruiker toe om de subcellulaire lokalisatie alsmede morfologische en / of ultrastructurele veranderingen geïnduceerd door de microgeïnjecteerde molecule plaats (Fig. 4). Deze techniek is ontvankelijk voor tijdstippen van ≤ 5 s tot enkele uren, afhankelijk van de aard van de microgeïnjecteerde monster.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlatieve Confocal en 3D Electron Microscopy van een specifiek Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy van Gemacereerde Tissue te visualiseren de extracellulaire matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...