Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Alto pour des discussions utiles. Nous remercions également le Fonds pour l&#39;imagerie moléculaire et cellulaire à l&#39;UT Southwestern Medical Center, en particulier le Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, et Laurie Mueller pour l&#39;expertise technique et des conseils. Nous remercions également le Dr Dong Xionan pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail est soutenu par le NIH subvention AI083359 à NMA

1. Culture des cellules de mammifères <ol><li> Rein de rat normal (NRK), immortalisé cancer du col utérin (HeLa), ou d&#39;autres lignées cellulaires de mammifères appropriées sont mises en culture à 37 ° C, 5% de CO 2, sur des lamelles de verre photodécoupe maillées apposées à vivre plats cellulaires (voir le tableau 1 pour n&#39;importe quel réactif ou appareil utilisé dans ce protocole) dans FBS DMEM + 10% et 1% Pen / Strep. Des précautions doivent être prises pour mainte...

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	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

La méthode présentée ici permet la livraison directe des protéines, des acides nucléiques purifiés, ou des petites molécules dans le cytoplasme eucaryote et offre ultra-haute résolution grâce à l&#39;analyse de la corrélation de la microscopie à fluorescence et électronique. L&#39;utilisation de cette méthode est simple mais robuste et peut être réalisée en interne avec de nombreuses installations de base existantes et / ou des laboratoires convenablement équipés en microscopie électronique. La techn...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Lamelles en photodécoupe et cellules vivantes Plate </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blue </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine kit de marquage </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um unité de filtration centrifuge </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettes en verre borosilicate </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modèle P-97 </td><td> Utilisez le programme n ° 4 après l&#39;exécution de test de rampe </td></tr><tr><td> Système de micro-injection FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Fluide Retrait lamelle </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai microscope électronique à transmission </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

La cellule eucaryote dépend complexe, très réglementé, et fonctionnellement distinctes compartiments membranaires liés à préserver une polarité biochimique nécessaire à la fonction cellulaire adéquate. Comprendre comment les enzymes, les protéines et les composants du cytosquelette gouverner et maintenir cette séparation biochimique est donc d&#39;une importance primordiale. L&#39;utilisation de molécules marquées par fluorescence de localiser et / ou perturbent compartiments subcellulaires a révélé une mine de connaissances et de faire progresser notre compréhension de la régulation cellulaire. Les techniques d&#39;imagerie telles que la microscopie confocale fluorescente et faire déterminer la position d&#39;une molécule fluorescente marqués petite relativement simple, mais la résolution de très petites structures est limitée 1. D&#39;autre part, la microscopie électronique a révélé les détails de la morphologie subcellulaire à très haute résolution, mais son caractère statique, il est difficile de mesurer très dynamique processus avec précision 2,3. Ainsi, la combinaison de la microscopie optique à la microscopie électronique d&#39;un même échantillon, appelé Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) 4,5, offre le double avantage de l&#39;imagerie de fluorescence ultra-rapide avec la haute résolution de la microscopie électronique 6. Cette technique puissante a été mis en place pour étudier de nombreux aspects de 5,7 biologie cellulaire. Depuis sa création, cette procédure a accru notre capacité à distinguer les architectures subcellulaires et des morphologies à haute résolution. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour la réalisation de micro-injection rapide suivie d&#39;CLEM (Fig. 1). La procédure CLEM micro-injection peut être utilisé pour introduire des quantités spécifiques de petites molécules et / ou des protéines directement dans le cytoplasme de cellules eucaryotes et étudier les effets du millimètre à plusieurs nanomètres résolution (Fig. 2). La technique est basée sur la micro-injectioncellules cultivées sur des lamelles en verre gravé au laser par maille fixé au fond de vaisselle de cellules vivantes et l&#39;imagerie par microscopie confocale à la fois fluorescent et d&#39;électrons. Localisation de la cellule (s) d&#39;intérêt est facilitée par la configuration de grille, qui est facilement transférable, avec des cellules d&#39;intérêt, de la résine Epon utilisé pour l&#39;immobilisation des échantillons et de sectionnement avant analyse par microscopie électronique (fig. 3). Superposition des images fluorescentes et EM permet à l&#39;utilisateur de déterminer la localisation subcellulaire ainsi que les modifications morphologiques et / ou ultrastructurales induites par la molécule d&#39;intérêt microinjecté (Fig. 4). Cette technique se prête à des points de temps allant de ≤ 5 s jusqu&#39;à plusieurs heures, selon la nature de l&#39;échantillon microinjectés.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

La technique CLEM a été conçu pour analyser la morphologie ultrastructurale des membranes, les organites subcellulaires, et des structures affectées par micro-injection des molécules. Cette méthode combine les techniques puissantes de micromanipulation / microinjection, microscopie confocale à fluorescence et microscopie électronique pour permettre millimètre à résolution nanométrique multi-. Cette technique se prête à une grande variété d&#39;applications.

Lumière corrélative et microscopie électronique (CLEM) comme un outil pour visualiser des molécules et de leurs microinjecté eucaryotes Sous-cellulaires cibles


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

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