Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת אלטו לדיונים מועילים. אנו מודים גם להדמיה מתקן מולקולרי ותאי במרכז רפואי UT Southwestern, במיוחד ד&quot;ר כריס גילפין, טום Januszewski, וורי מילר למומחיות וייעוץ טכניים. אנו מודים גם לד&quot;ר Xionan דונג לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH AI083359 לNMA

1. תרבות של תאי יונקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליות חולדה רגילות (NRK), הונצחו סרטן צוואר רחם (הלה), או שורות תאים אחרות מתאימות יונקים מתורבתים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, על coverslips gridded זכוכית המודבקת photoetched לחיות מנות סלולריות (ראה טבלת מ?...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת העברה הישירה של חלבונים מטוהרים, חומצות גרעין, או מולקולות קטנות לציטופלסמה האיקריוטים ומאפשרת ניתוח אולטרה ברזולוציה גבוהה באמצעות המתאם של מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרון. השימוש בשיטה זו הוא פשוט אך חזק וניתן לבצעו בבית עם מתקנים רבים קיימים ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Coverslip Photoetched ופלייט Live-תא </td><td> מאטק </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> טקסס האדומה </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> מפל הכחול </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine התיוג Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> יחידת הסינון צנטריפוגלי מיקרומטר 0.22 </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> פיפטות הזכוכית ורוסיליקט </td><td> סאטר מכשירים </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette פולר </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td><td> השתמש בתכנית המס &#39;4 לאחר ביצוע בדיקת רמפה </td></tr><tr><td> מערכת microinjection FemtoJet </td><td> אפנדורף </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> נוזל להסרת coverslip </td><td> מאטק </td><td> PDCF 30 OS </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים Technai </td><td> פיי </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> ליקה </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

תא האיקריוטים מסתמך על מורכב, פיקוח הדוק, ותאים כפותים קרום תפקודי שונים שישמרו קוטביות צורך ביוכימי לתפקוד תאי תקין. הבנה כיצד אנזימים, חלבונים ורכיבי cytoskeletal למשול ולשמור על פרדה ביוכימי זה היא אפוא בעלת חשיבות עליונה. השימוש במולקולות מתויגות fluorescently למקם ו / או תאים subcellular יפריעו הניבו שפע של ידע וההבנה מתקדמות של רגולציה הסלולרית שלנו. שיטות הדמיה כגון מיקרוסקופיה confocal ניאון ולהפוך את בירור עמדתו של מולקולה מתויגת fluorescently קטנה פשוטה יחסית, עם זאת הרזולוציה של מבנים קטנים מאוד מוגבלת 1. מצד השני, מיקרוסקופי אלקטרונים חשף פרטים של מורפולוגיה subcellular ברזולוציה גבוהה מאוד, אבל אופי סטטי עושה את זה קשה למדוד פרו דינמי מאודcesses עם דיוק 2,3. לפיכך, שילוב של מיקרוסקופ אור במיקרוסקופ אלקטרונים שלו המדגם, אור גומל כינה ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) 4,5, מעניק את היתרונות הכפולים של הדמית ניאון ultrafast עם הרזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה אלקטרונית 6. טכניקה רבה עצמה זו יושמה כדי ללמוד על היבטים רבים של ביולוגיה של תא 5,7. מאז הקמתה, הליך זה גדל יכולתנו להבחין ארכיטקטורות ומורפולוגיות subcellular ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לביצוע microinjection המהיר ובעקבות קלם (1 איור). הליך קלם microinjection ניתן להשתמש כדי להציג את הכמויות ספציפיות של מולקולות קטנות ו / או חלבונים ישירות לתוך הציטופלסמה תא האיקריוטים ולחקור את ההשפעות ממילימטר לרזולוציה רב ננומטר (איור 2). הטכניקה מתבססת על microinjectingתאים גדלו על coverslips הליזר החרוט זכוכית gridded מודבק בתחתית של מנות תא חיים והדמיה עם שניהם מיקרוסקופיה ניאון ואלקטרון confocal. לוקליזציה של התא (הים) של עניין היא בנחייתם של דפוס הרשת, המועבר בקלות, יחד עם התאים של עניין, לשרף EPON משמש לקיבוע של דגימות וחתך לפני הניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים (3 איור). כיסוי של הניאון וEM תמונות מאפשר למשתמש לקבוע את לוקליזציה subcellular כמו גם שינויים מורפולוגיים ו / או ultrastructural הנגרמים על ידי מולקולת microinjected ריבית (איור 4). טכניקה זו היא נוחה לנקודתי זמן שנעו בין 5 ≤ של עד כמה שעות, בהתאם לאופי של מדגם microinjected.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

טכניקת קלם הותאמה לנתח מורפולוגיה ultrastructural של קרומים, האברונים, ומבני subcellular מושפעים מולקולות microinjected. שיטה זו משלבת טכניקות רבות העצמה של המיקרומניפולציה / microinjection, מיקרוסקופיה confocal ניאון, וכן במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאפשר מילימטר לרזולוציה רבה ננומטר. טכניקה זו היא נוחה למגוון רחב של יישומים.

אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

המבדק Electroantennographic ככלי מיון עבור נדיפים צמחים מארח

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...