Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Ringraziamo i membri del laboratorio Alto per le discussioni utili. Ringraziamo anche lo strumento per imaging molecolare e cellulare del Southwestern Medical Center, in particolare il dottor Chris Gilpin, Tom Januszewski, e Laurie Mueller per la competenza tecnica e consulenza. Ringraziamo anche il Dott. Xionan Dong per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è sostenuto da NIH sovvenzione AI083359 a NMA

1. Colture Cellulari mammiferi <ol><li> Rene di ratto normale (NRK), immortalata tumore della cervice uterina (HeLa), o di altre linee cellulari di mammiferi appropriate sono coltivate a 37 ° C, 5% di CO 2, su vetrini fotoincisioni gridded apposti a vivere piatti cellulari (vedi Tabella 1 per ogni reagente o apparecchiatura utilizzata in questo protocollo) in DMEM + 10% FBS e 1% Pen / Strep. Devono essere prese precauzioni per mantenere un ambiente sterile quando si lavora con una coltura ...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

Il metodo qui presentato permette la fornitura diretta di proteine ​​purificate, acidi nucleici, o piccole molecole nel citoplasma eucariotico e offre ultra analisi ad alta risoluzione attraverso la correlazione di microscopia a fluorescenza ed elettronica. L&#39;uso di questo metodo è semplice ma robusto e possono essere eseguite in-house con molti servizi di base esistenti e / o opportunamente attrezzati laboratori di microscopia elettronica. La tecnica è anche soggetto a live-cella, permettendo all&#39;utente d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Coverslip Fotoincisioni e Live-cell piastra </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Blu </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 unità di micron di filtrazione centrifuga </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette in vetro borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modello P-97 </td><td> Utilizzare il programma # 4 dopo aver eseguito test di rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet Microiniezione sistema </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip rimozione dei liquidi </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmission Electron Microscope </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

La cellula eucariotica si basa su complessi, altamente regolamentato, e compartimenti di membrana funzionalmente distinti associati, che conservano una polarità biochimica necessaria per una corretta funzione cellulare. Capire come gli enzimi, proteine, e componenti del citoscheletro governare e mantenere questa separazione biochimica è quindi di fondamentale importanza. L&#39;utilizzo di molecole fluorescenti tag di localizzare e / o turbano compartimenti subcellulari ha prodotto un patrimonio di conoscenze e avanzato la nostra comprensione della regolazione cellulare. Tecniche di imaging come la microscopia confocale a fluorescenza e rendere esaminano la posizione di una molecola fluorescente etichettato piccola relativamente semplice, tuttavia la risoluzione di strutture molto piccole è limitato 1. D&#39;altra parte, microscopia elettronica ha rivelato i dettagli di morfologia subcellulare ad altissima risoluzione, ma la sua natura statica rende difficile misurare pro altamente dinamicoprocessi con precisione 2,3. Pertanto, la combinazione di microscopio ottico con il microscopio elettronico dello stesso campione, chiamato Luce correlativa e Microscopia Elettronica (CLEM) 4,5, offre il duplice vantaggio di imaging fluorescente con ultraveloce ad alta risoluzione della microscopia elettronica 6. Questa potente tecnica è stata implementata per studiare molti aspetti della biologia cellulare 5,7. Fin dalla sua nascita, questa procedura ha aumentato la nostra capacità di distinguere architetture subcellulari e morfologie ad alta risoluzione. Qui, presentiamo un metodo semplificato per eseguire microiniezione rapida seguita da CLEM (Fig. 1). La procedura CLEM microiniezione può essere utilizzato per introdurre quantità specifiche di piccole molecole e / o proteine ​​direttamente nel citoplasma delle cellule eucariotiche e studiare gli effetti di millimetro a multi-nanometri risoluzione (Fig. 2). La tecnica si basa sul microinjectingcellule coltivate su vetrini con laser a griglia applicata sul fondo dei piatti cellule vive e immagini sia con la microscopia confocale a fluorescenza ed elettronica. Localizzazione della cella (s) di interesse è facilitata dalla griglia, che viene facilmente trasferita, insieme con le cellule di interesse, alla resina Epon utilizzato per l&#39;immobilizzazione di campioni e sezionamento prima analisi microscopia elettronica (Fig. 3). Sovrapposizione di immagini fluorescenti e EM permette all&#39;utente di determinare la localizzazione subcellulare nonché eventuali cambiamenti morfologici e / o ultrastrutturali indotte dalla molecola microiniezione di interesse (Fig. 4). Questa tecnica è suscettibile di punti di tempo variabili da ≤ 5 s fino a diverse ore, a seconda della natura del campione microiniezione.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

La tecnica CLEM è stato adattato per analizzare morfologia ultrastrutturale delle membrane, organelli e strutture subcellulari affetti da molecole microiniezione. Questo metodo combina le potenti tecniche di micromanipolazione / microiniezione, microscopia confocale a fluorescenza, e la microscopia elettronica per consentire millimetro a multi-risoluzione nanometrica. Questa tecnica è suscettibile di una vasta gamma di applicazioni.

Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Ricerca

Biologia

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlativo confocale e 3D microscopia elettronica di una cellula sensoriale specifico

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena mediante microscopia elettronico-ottica correlativa in sezione

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Epon Post Embedding Microscopia Ottica ed Elettronica Correlativa

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...