Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
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我々は有用な議論アルト研究室のメンバーに感謝。我々はまた、技術的な専門知識とアドバイスを博士クリス·ギルピン、トムJanuszewski、とローリーミューラー具体的には、UTの南西医療センターの分子細胞イメージング施設に感謝します。また、原稿の批判的な読みのために博士Xionanドンに感謝します。この作品は、NMAにNIHの助成金AI083359でサポートされています

1。哺乳動物細胞培養<ol><li>正常ラット腎（NRK）、不死化子宮頸癌（HeLa細胞）、または他の適切な哺乳動物細胞株を37℃で培養される℃、5％CO 2は 、セル料理を生きるために貼付フォトエッチングガラスグリッド化されたカバースリップ上で（任意の試薬 ​​については、 表1を参照するか、 DMEM中でこのプロトコルに使用される装置）+ 10％FBSおよび1％ペニ...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

ここで紹介する方法は、真核生物の細胞質に精製されたタンパク質、核酸、または小分子を直接配信することを可能にし、蛍光および電子顕微鏡の相関関係により超高分解能分析を与える。このメソッドの使用方法はシンプルなもので、様々な既存のコア施設及び/または適切に装備され、電子顕微鏡の研究室で、社内で行うことができます。技術は、ユーザがリアルタイムで蛍光標識された...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>フォトエッチングカバーガラスとライブセルプレート</td><td>マテック</td><td> P35G-2-14-CGR​​D </td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッド</td><td>インビトロジェン</td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td>カスケードブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td>ローダミン標識キット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μmの遠心ろ過ユニット</td><td>ミリポア</td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF100-50から10 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP-97 </td><td>ランプテストを実行した後にプログラム＃4を使用</td></tr><tr><td> FemtoJetのマイクロインジェクションシステム</td><td>エッペンドルフ</td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップの除去液</td><td>マテック</td><td> PDCFのOS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai透過型電子顕微鏡</td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td>ライカ</td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

真核細胞は、複雑に依存して高度に規制され、適切な細胞機能のために必要な生化学的な極性を維持する機能的に異なる膜結合コンパートメント。酵素、タンパク質、および細胞骨格成分がこの生化学的分離を支配し、維持する方法を理解することが極めて重要でことである。および/または混乱させる細胞内コンパートメントローカライズする蛍光標識分子の使用は、豊富な知識を得られたと携帯規制の我々の理解を進めてきた。蛍光、共焦点顕微鏡などのイメージング技術は比較的単純蛍光標識小分子の位置を確認し、しかし、非常に小さな構造の分解能は1に制限されます。 一方、電子顕微鏡は、非常に高い解像度で細胞内の形態の詳細を明らかにしたが、その静的な性質は、それが困難な高度に動的なプロを測定することができる精度2,3とcesses。したがって、同じ試料の電子顕微鏡と呼ばれる相関光学および電子顕微鏡と光学顕微鏡との組み合わせ（CLEM）4,5は 、電子顕微鏡6の高解像度を持つ超高速蛍光イメージングの二重の利点が得られる。この強力な技術は、細胞生物学5,7の多くの側面を研究するために実装されています。創業以来、この手順では、高解像度で細胞内のアーキテクチャや形態を区別するために我々の能力を高めている。 ここでは、CLEM（ 図1）に続いて急速なマイクロインジェクションを実行するための効率的な方法を提示します。マイクロインジェクションのCLEMプロシージャが直接真核細胞の細胞質に小分子および/ ​​またはタンパク質の特定の量を導入し、ミリメートルからマルチナノメートルの分解能（ 図2）への影響を研究するために使用することができます。技術はマイクロインジェクションに基づいている細胞は両方共焦点蛍光顕微鏡および電子顕微鏡でライブセルイメージング料理との裏面に貼付レーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上に成長させた。興味のあるセル（複数可）の局在を容易に試料の固定化に使用エポン樹脂に、目的の細胞と一緒に、転送され、電子顕微鏡分析（ 図3）に先立ってセクショニングされるグリッドパターンによって促進される。蛍光およびEM画像のオーバーレイは、ユーザーが同様に関心のマイクロインジェクション分子（ 図4）により誘導される任意の形態学的および/ ​​または微細構造の変化などの細胞内局在を決定することができます。この手法は、マイクロインジェクション試料の性質に応じて、いくつかの時間≤5秒からまでの範囲の時間ポイントに適している。

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...