Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Agradecemos a membros do laboratório Alto para discussões úteis. Agradecemos também a Facilidade Imagem Molecular e Celular da UT Southwestern Medical Center, especificamente o Dr. Chris Gilpin, Januszewski Tom, e Mueller Laurie para perícia técnica e aconselhamento. Agradecemos também o Dr. Xionan Dong para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão AI083359 a NMA

1. Cultura de Células de mamífero <ol><li> Rim de Rato Normal (NRK), imortalizada cancro cervical (HeLa), ou outras linhas celulares de mamífero adequadas são cultivadas a 37 ° C, 5% CO 2, em lamelas de vidro em grade photoetched afixados viver pratos de células (ver Tabela 1 para qualquer reagente ou aparelho utilizado neste protocolo) em DMEM + 10% FBS e 1% de Pen / Strep. Precauções devem ser tomadas para manter um ambiente estéril quando se trabalha com cultura de células de m...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

O método aqui apresentado permite a entrega directa de proteínas purificadas, ácidos nucleicos, ou moléculas pequenas para o citoplasma eucariótico e permite a análise de alta resolução ultra através da correlação de microscopia de fluorescência e de electrões. A utilização deste método é simples e robusto e pode ser realizado in-house com muitas instalações nucleares existentes e / ou laboratórios adequadamente equipados de microscopia electrónica. A técnica é também passível de live-célula, q...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Coverslip Photoetched e Live-célula Placa </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascata Azul </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina Labeling Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 unidade de filtração centrífuga uM </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidro de borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-97 </td><td> Utilize o programa # 4 após a realização de teste de rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet Sistema Microinjeção </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Lamela Fluid Remoção </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai microscópio eletrônico de transmissão </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

A célula eucariótica depende complexo, altamente regulado, e compartimentos da membrana acoplados funcionalmente distintos que preservam a polaridade bioquímico necessário para a função celular adequada. Entender como as enzimas, proteínas e componentes do citoesqueleto governar e manter esta segregação bioquímica é, portanto, de suma importância. A utilização de moléculas fluorescentes marcadas para localizar e / ou perturbam compartimentos subcelulares rendeu uma riqueza de conhecimentos e avanços na compreensão da regulação celular. Técnicas de imagiologia tais como a microscopia de fluorescência confocal e fazer a determinar a situação de uma molécula fluorescente etiquetado pequeno relativamente simples, no entanto a resolução de estruturas muito pequenas é limitada 1. Por outro lado, a microscopia electrónica revelou detalhes da morfologia subcelular com resolução muito elevada, mas a sua natureza estática torna mais difícil de medir pró altamente dinâmicosos com precisão 2,3. Assim, a combinação de microscopia de luz por microscopia de electrões de uma mesma amostra, denominado microscópio óptico e electrões (CLEM) 4,5, proporciona as vantagens duplas de ultra imagem fluorescente com a alta resolução de microscopia electrónica de 6. Esta poderosa técnica foi implementada para estudar vários aspectos da biologia celular 5,7. Desde a sua criação, este procedimento tem aumentado a nossa capacidade de distinguir arquiteturas subcelulares e morfologias em alta resolução. Aqui, apresentamos um método simplificado para a realização de microinjeção rápida seguida de CLEM (Fig. 1). O procedimento CLEM microinjecção pode ser utilizado para introduzir quantidades específicas de moléculas pequenas e / ou proteínas directamente para o citoplasma da célula eucariótica e estudar os efeitos de milímetro a nanometros de multi-resolução (Fig. 2). A técnica baseia-se na microinjectingcélulas cultivadas em lamínulas gravadas a laser de vidro grade aposta para o fundo de pratos de células vivas e de imagem com tanto microscopia confocal fluorescente e eletrônica. Localização da célula (s) de interesse é facilitado pelo padrão de grade, a qual é facilmente transferido, juntamente com as células de interesse, para a resina Epon utilizado para imobilização de amostras e de corte antes da análise por microscopia de electrões (fig. 3). Sobreposição de imagens de fluorescência e EM permite ao utilizador determinar a localização subcelular, assim como quaisquer alterações morfológicas e / ou induzidos por ultra-estrutural da molécula de interesse microinjectados (Fig. 4). Esta técnica é passível de pontos de tempo variando de ≤ 5 s até várias horas, dependendo da natureza da amostra microinjectados.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

A técnica CLEM foi adaptado para analisar a morfologia ultraestrutural de membranas, organitos e estruturas subcelulares afectados por moléculas microinjectados. Este método combina as técnicas poderosas de micromanipulação / microinjeção, microscopia confocal, fluorescentes e microscopia eletrônica para permitir milímetros de multi-resolução nanométrica. Esta técnica é susceptível a uma grande variedade de aplicações.

Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biologia

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlativo Confocal e Microscopia Eletrônica 3D de uma célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...