Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
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Damos las gracias a los miembros del Alto laboratorio útil para los debates. También agradecemos a El Fondo para Imagen Molecular y Celular de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, específicamente el Dr. Chris Gilpin, Januszewski Tom, y Mueller Laurie por su experiencia técnica y asesoramiento. También agradecemos al Dr. Dong Xionan para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención AI083359 a NMA

1. Cultivo de células mamíferas <ol><li> Riñón de rata normal (NRK), inmortalizada cáncer de cuello uterino (HeLa), u otras líneas celulares de mamífero adecuadas se cultivan a 37 ° C, 5% de CO 2, en cubreobjetos de vidrio fotograbados reticulados fijados a vivir platos de células (véase la Tabla 1 para cualquier reactivo o aparato usado en este protocolo) en DMEM + 10% de FBS y 1% Pen / Strep. Se deben tomar precauciones para mantener un ambiente estéril cuando se trabaja con c?...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

El método que aquí se presenta permite la entrega directa de las proteínas, ácidos nucleicos purificados, o pequeñas moléculas al citoplasma eucariótico y proporciona ultra alta resolución a través de análisis de la correlación de microscopía de fluorescencia y electrónica. El uso de este método es simple, pero robusto y se puede realizar en casa con muchas instalaciones de base existentes y / o debidamente equipados laboratorios de microscopía electrónica. La técnica es también sensible a la célula v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cubreobjetos Fotograbado y placa en vivo de células </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascada Azul </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina Etiquetado Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 m unidad de filtración centrífuga </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de vidrio de borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetas Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modelo P-97 </td><td> Utilice el programa n º 4 después de realizar la prueba de rampa </td></tr><tr><td> FemtoJet sistema de microinyección </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos líquido eliminación </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Microscopio Electrónico de Transmisión </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

La célula eucariota se basa en la compleja, altamente regulado, y los compartimentos de membrana ligados funcionalmente distintas que conservan una polaridad necesaria bioquímico para la correcta función celular. La comprensión de cómo las enzimas, proteínas, y componentes del citoesqueleto gobernar y mantener esta segregación bioquímica tanto, es de suma importancia. El uso de moléculas marcadas con fluorescencia para localizar y / o perturbar los compartimentos subcelulares se ha producido una gran cantidad de conocimientos y avanzar en nuestra comprensión de la regulación celular. Las técnicas de imagen tales como microscopía de fluorescencia confocal y hacer la determinación de la posición de una molécula de marcado fluorescentemente pequeña relativamente sencillo, sin embargo, la resolución de estructuras muy pequeñas se limita 1. Por otra parte, la microscopía electrónica ha revelado los detalles de la morfología subcelular a una resolución muy alta, pero su naturaleza estática hace que sea difícil de medir pro altamente dinámicoprocesos con precisión 2,3. Así, la combinación de la microscopía de luz con el microscopio electrónico de la misma muestra, Light denomina correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) 4,5, proporciona la doble ventaja de formación de imágenes ultrarrápida fluorescente con la alta resolución de la microscopía electrónica 6. Esta poderosa técnica se ha aplicado para estudiar muchos aspectos de la biología celular 5,7. Desde su creación, este procedimiento ha aumentado nuestra capacidad de distinguir las arquitecturas subcelulares y morfologías de alta resolución. A continuación, presentamos un método simplificado para realizar la microinyección rápida seguida de CLEM (Fig. 1). El procedimiento de CLEM microinyección puede ser utilizado para introducir cantidades específicas de moléculas pequeñas y / o proteínas directamente en el citoplasma de células eucariotas y estudiar los efectos de un milímetro a la resolución de varios nanómetros (Fig. 2). La técnica se basa en la microinyecciónlas células cultivadas en cubreobjetos de vidrio grabado láser reticulados fijados a la parte inferior de platos y de formación de imágenes de células vivas con tanto microscopía confocal fluorescente y electrones. La localización de la célula (s) de interés se ve facilitada por el patrón de rejilla, que se transfiere fácilmente, junto con las células de interés, a la resina Epon utilizado para la inmovilización de muestras y corte antes del análisis de microscopía electrónica (Fig. 3). Superposición de fluorescencia y las imágenes EM permite al usuario determinar la localización subcelular, así como los cambios morfológicos y / o ultraestructurales inducidas por la molécula microinyectado de interés (Fig. 4). Esta técnica es susceptible de puntos de tiempo que van desde ≤ 5 s hasta varias horas, dependiendo de la naturaleza de la muestra microinyectado.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

La técnica CLEM se ha adaptado para analizar la morfología ultraestructural de las membranas, orgánulos, y estructuras subcelulares afectados por moléculas microinyectados. Este método combina las poderosas técnicas de micromanipulación / microinyección, microscopía fluorescente confocal y microscopía electrónica para permitir a milímetro resolución nanométrica múltiples. Esta técnica es viable para una amplia variedad de aplicaciones.

Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Investigación

Biología

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Preparación de los organismos procarióticos y eucarióticos con secado químico para análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Localización ultraestructural de LC3 endógena mediante microscopía óptica correlativa en sección

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...