Name: correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Biz yararlı tartışmalar için Alto laboratuar üyelerine teşekkür. Biz de teknik uzmanlık ve danışmanlık için UT Southwestern Tıp Merkezi, özellikle Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, ve Laurie Mueller de Moleküler ve Hücresel Görüntüleme Tesis ederim. Biz de elyazmasının eleştirel okuma için Dr Xionan Dong ederim. Bu çalışma NMA için NIH hibe AI083359 tarafından desteklenmektedir

1. Memeli Hücre Kültürü <ol><li> Normal Sıçan Böbrek (NRK), (herhangi bir reaktif için Tablo 1&#39;e bakınız veya hücre yemekleri yaşamak yapıştırılmış photoetched cam gridded lamelleri üzerine serviks kanseri (HeLa), ya da diğer uygun memeli hücre hatları 37 kültüre ° C,% 5 CO 2, ölümsüzleştirdi aparatı DMEM +% 10 FBS) Bu protokolde kullanılan ve% 1 Kalem / Strep. Önlemler kültürlü memeli hücreleri ile çalışırken steril bir ortam sağlamak için alı...

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

Burada sunulan yöntem ökaryotik sitoplazmaya saflaştırılmış proteinler, nükleik asitler, veya küçük moleküllerin doğrudan teslim edilmesini sağlayan ve floresan ve elektron mikroskobu korelasyon yoluyla ultra yüksek çözünürlük analizi tanıyor. Bu yöntemin kullanılması basit ama sağlam ve çok sayıda mevcut temel tesisleri ve / veya uygun bir alet elektron mikroskopisi laboratuarları ile in-house gerçekleştirilebilir. Tekniği kullanıcının gerçek zamanlı floresan etiketli moleküllerin d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Photoetched lamel ve Canlı hücre Plakalı </td><td> Mattek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Mavi </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamin Etiketleme Kiti </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 mikron santrifüj ile filtrasyon ünitesi </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat Cam Pipetler </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet Çektirme </td><td> Sutter Aletleri </td><td> Model P-97 </td><td> Rampa testi yaptıktan sonra programı # 4 kullanın </td></tr><tr><td> FemtoJet Mikroenjeksiyon Sistemi </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Lamel Temizleme Sıvısı </td><td> Mattek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmisyon Elektron Mikroskobu </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

Ökaryotik hücre, kompleks dayanan son derece düzenlenir ve uygun hücre fonksiyonu için gerekli olan biyokimyasal polarite koruma işlevsel farklı membrana bağlı bölmeleri. Enzimler, proteinler ve hücre iskelet yapısı bu biyokimyasal segregasyon yöneten ve bakımını nasıl anlamak büyük önem taşımaktadır. Floresan etiketli moleküllerin kullanımı veya perturb Subselüler bölmeleri bilgi hazinesi vermiştir ve hücresel düzenleme anlayışımızı ilerlemiştir ve / yerelleştirilmesine. Böyle floresan ve konfokal mikroskopi gibi görüntüleme teknikleri nispeten basit bir floresan etiketli küçük molekülün konumunu ascertaining olun, çok küçük yapıların ancak çözünürlük 1 sınırlıdır. Diğer taraftan, elektron mikroskobu çok yüksek çözünürlükte Subselüler morfoloji detayları ortaya koymuştur, ancak statik doğa zor derece dinamik yanlısı ölçmek için yaparHassas 2,3 ile lerle. Böylece, aynı numunenin elektron mikroskobu, adlandırılır Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) 4,5 ile ışık mikroskobu birleşimi, elektron mikroskobu 6 yüksek çözünürlüklü ultrafast floresan görüntüleme ikili avantajları tanıyor. Bu güçlü teknik hücre biyolojisi 5,7 birçok yönlerini incelemek amacıyla uygulamaya konmuştur. Kuruluşundan bu yana, bu prosedür yüksek çözünürlükte Subselüler mimarileri ve morfolojileri ayırt yeteneğimizi artmıştır. Burada, CLEM (Şekil 1), ardından hızlı mikroenjeksiyon gerçekleştirilmesi için düzenlenmiş bir yöntem sunulmaktadır. Mikroenjeksiyon CLEM işlem doğrudan ökaryotik hücre sitoplazması içine küçük molekülleri ve / ya da proteinlerin spesifik miktarlarda tanıtmak ve (Şek. 2), çok nm çözünürlüğe kadar milimetre olan etkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, microinjecting dayanmaktadırhücreler hem konfokal floresan ve elektron mikroskobu ile canlı hücre yemekleri ve görüntüleme altına yapıştırılmıştır lazer kazınmış cam gridded lamelleri üzerine büyüdü. İlgi hücre lokalizasyonu (ler) kolaylıkla (Şek. 3) örneklerinin immobilizasyon için kullanılan EPON Reçine, ilgi hücreleri ile birlikte, transfer edilen önceki ve elektron mikroskopi ile analiz kesit bir ızgara deseni ile kolaylaştırılır. Floresan ve EM görüntü Kaplama kullanıcı hücre içi lokalizasyonu hem de ilgi enjekte edilen molekül (Şekil 4) tarafından oluşturulan herhangi bir morfolojik ve / veya yapısal değişikliklerin belirlemesini sağlar. Bu teknik, enjekte edilen örnek doğasına bağlı olarak, birkaç saat ≤ 5 sn kadar değişen zaman noktaları için müsait.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Novel Protocol for Simultaneous Fluorescence and Ultrastructure Preservation

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Author Spotlight: Advancements in Correlative Light and Electron Microscopy with Fluorescent Protein Preservation

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...