Name: assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

1. تلوين خلايا مع مجموعة الاستمرارية طالي -- الميت الكاشف خلية الأحمر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ هذا الإجراء مع الخلايا U2OS (كوكتيل الثقافة الأمريكية نوع) التي تم transduced باستخدام CellLight نيوكليوس - GFP BacMam * 2.0 *. (ملاحظة : يمكن أيضا أن تكون خلايا نسج أسفل ومعلق في المتوسط ​​أو برنامج تلفزيوني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصبغ الخلايا الميتة مع PI ، ونقل 100 ميكروليتر من الخلايا لأنبوب microcentrifuge جديدة. علما بأن ينصح بتركيز 1 × 05 حتي 01 أكتوبر مل / س 10 7 خلايا لهذا الاختبار ، على الرغم من أن التركيز لم يكن على وجه الدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القادم ، وصمة عار على الخلايا الميتة ، إضافة 1 ميكروليتر من كاشف طالي PI المستندة إلى خلية الميت الأحمر. لفترة وجيزة إلى دوامة المزيج. احتضان الأحمر الميت طالي خلية الكاشف وخليط الخلايا في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة ، الشروع فورا في تحليل العينة على عداد الكريات يستند إلى صورة تالي. </li></ol> 2. إجراء الفحص بقاء الخلية باستخدامكاحل يستند إلى صورة عداد الكريات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم عداد الكريات طالي البلاستيكية الخلوية تحليل الشرائح طالي التي تناسب تحديدا في عداد الكريات ويمكن أن تعقد عينتين 25μL في غرف مغلقة منفصلة (A و B). عند التعامل مع الشريحة ، ومن المؤكد أن تعقد دائما من قبل الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل الشرائح ، ماصة 25 ميكروليتر من عينة ببطء في نصف القمر على شكل نموذج منطقة التحميل ، مع الحرص على تجنب تشكيل فقاعات أو الظهر ترشيش. لا تزيد ولا تقل عن ملئه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا ، يتم تحميل خلايا تحكم (غير ملوثين ، وعدم transduced) في القاعة ألف والملون ، معربا عن GFP. يتم تحميل خلايا باء في غرفة العينة السيطرة ستساعد على تحديد مستوى تألق ذاتي عند تحليل البيانات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء فحص السلامة ، المس GFP / RFP على الشاشة الرئيسية للعداد الكريات. سوف تظهر الخيارات مقايسة ثم على اليمين. حدد GFP + الاستمرارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، على سبيل المثال سلسلة عينة ، اضغط اسم الآن </strong&gt;. ثم ، وذلك باستخدام شاشة تعمل باللمس ، واكتب اسم سلسلة العينة ، ووفر الصحافة. (ملاحظة : الاسم في وقت لاحق لتحديد تلقائيا تعيين اسم لكل عينة من سلسلة التاريخ والوقت.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تسمية العينة ، فإن عداد الكريات طالي مسبقا تلقائيا إلى الشاشة قياس. اضغط على التبويب الخلفية في أسفل النصف الأيمن من الشاشة قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، مع عينة التحكم (أ) التي تواجه بعيدا عن عداد الكريات ، إدراج شريحة في مرفأ التحميل حتى تتوقف. لا تطبق بالقوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الشاشة الخلفية ، اضغط على لمسة إدراج خلية جديدة للمراقبة غير ملوثين. سيتم تلقائيا الشريحة يتم سحبها في عداد الكريات ، وسوف يتم عرض صورة حية من الخلايا التي تظهر على الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقبض التركيز ، وجعل هذه الخلايا في الطائرة السليم للعرض. ينبغي أن تكون مظلمة الخلايا بشكل موحد مع هالة مشرقة حول كل خلية (الشكل 1 ، يسار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخليةقد يكون قلل ق عند الانتقال بين الخلفية وحواف الخلايا هو غامض ، بحيث لا حدود واضحة المعالم الخلية (الشكل 1 ، ومركز). قد يكون overcounted الخلايا عندما يكون لديهم مراكز مشرق ومحيط الظلام (الشكل 1 ، يمين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرؤية أفضل للسكان الخلية مع التركيز ، حرك المؤشر أحمر الزر لتكبير 4X أو 16X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم جلب الخلايا في التركيز ، اضغط على لتشغيل لمسة غير ملوثين التحكم الخلية لقياس مضان الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف عداد الكريات تلقائيا التقاط الصور وتحليل العينة. يستغرق حوالي 1 دقيقة لالتقاط وتحليل الصور في الافتراضي (9 الصورة) واسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم عرض الصور المصغرة في كل مجال الرؤية كما يتم القبض عليهم وشريط تقدم تحديثا مستمرا. بعد التقاط الصورة كاملة ، وإخراج عداد الكريات تلقائيا الشريحة ويوفر البيانات من تحليل الصور الملتقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">سيتم عرض البيانات المخزنة في القائمة المنسدلة من علامة التبويب الخلفية في عداد الكريات. وسيتم تعيين عينة تحكم خلفية نفس اسم أنه بالنظر إلى التجربة وسوف يتم استيرادها من القائمة المنسدلة. ملاحظة : إذا لم يتم تشغيل التحكم الخلفية ، عداد الكريات تلقائيا بتعيين عتبة مضان. ويمكن تغيير هذا يدويا بعد إجراء الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشغيل العينة PI الملطخة transduced ، وإزالة الشريحة من عداد الكريات ، والوجه حولها ومعاودة مع العينة التي تواجه transduced بعيدا عن الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على التبويب نموذج ، ثم اضغط على اتصال إدراج نموذج جديد. عندما تظهر الصورة على الشاشة ، استخدم مفتاح التكيف الصورة لجعل الخلايا في التركيز كما كان من قبل. اللمس ثم اضغط على تشغيل نموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التقاط الصورة كاملة ، والبيانات من التحليل يظهر تحت علامة التبويب نموذج والتلقائي عداد الكرياتحليف إخراج الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصرف بشكل مناسب من التحليل طالي الشرائح الخلوية كنفايات biohazardous. لا يمكن تحليل الشرائح كاحل الخليوي يمكن استخدامها. </li></ol> 3. تحديد العتبات وغيتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تشغيل العينة ، ويمكن الآن عتبات يتم تطبيقها على عينة من المنزل على السكان في خلية معينة. هنا ، وسوف نقوم بتعديل العتبات لتحديد نسبة الخلايا الحية والميتة في GFP - transduced الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت علامة التبويب نموذج ، يتم عرض عدد ونسبة الخلايا معربا عن GFP ، والخلايا الحية والميتة معربا عن GFP ، البقاء الإجمالي ، متوسط ​​حجم الخلية ، وعدد الخلايا عدها ، وتركيز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض قطع الرسم البياني عرض حجم الخلية ، ومضان أخضر ، أحمر ومضان (PI) في أسفل الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعيين البوابة حجم الخلية ، تلمس حجم الخلية المصغرة لفتح الرسم البياني حجم الخلية. في حين أن الخلايا مثقف ونادرا ما يكون دebris ، قد تحتوي على عينات أخرى الحطام الذي هو أكبر أو أصغر من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستبعاد هذا الحطام ، الشريحة أزرار زرقاء على شريط التمرير لاستبعاد الأحداث الكبيرة والصغيرة على حد سواء. ثم ، لمسة على تطبيق لإعادة تحليل البيانات واستكمال النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، إضافة إلى مضان GFP للتحليل ، لمسة للإبهام GFP الرسم البياني لفتحه. حرك الشريط الأزرق لضبط عتبة عادل لليمين الأكثر خفوت الذروة ، وذلك باستخدام عينة السيطرة كدليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح هذا التحليل ليشمل الخلايا GFP إيجابية ، ولكنها تستبعد الخلايا autofluorescent. ويلاحظ في كثير من الأحيان عندما تألق ذاتي متحمسون الجزيئات البيولوجية داخل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتصال لتأكيد تطبيق والعودة إلى الشاشة السابقة. وينبغي أن البيانات المعروضة تحت علامة التبويب عينة تعكس الآن على أبواب وعتبات المحدد لكلتا القناتين مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، لفصل الخلايا PI الملون من تألق ذاتي ، اضغط رانه PI المصغرة الرسم البياني لفتح الرسم البياني PI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى ، سيتم عرض عينة ذروة السيطرة باعتبارها ذروة رمادية على الرسم البياني. ذروة الأحمر هو مضان العينة. يتم عرض مضان الخلفية باعتبارها ذروة الأقرب إلى القيمة 0 على هذا RFU عداد الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقضاء على مضان الخلفية في قناة بي ، حرك الزر الأزرق على شريط التمرير لضبط عتبة استبعاد تمثل ذروة مضان الخلفية ، وذلك باستخدام ذروة الرمادية من العينة تحكم كمرجع. اتصال لتأكيد تطبيق والعودة إلى الشاشة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، لتأكيد بصريا الذي تم تعيينه بشكل صحيح كل خلية ، حدد حقل القبض على النظر للمراجعة عن طريق الضغط على الصورة المصغرة للصورة في التبويب التكبير ، ثم الضغط على علامة التبويب الطبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، اضغط على زر أو GFP PI ، لعرض الصور الملتقطة من خلال هذه القناة خاصة. اضغط على نفس الزر مرة أخرى لإزالة طبقة من العرض ، أو ، إلى فرض طبقات ، طبقة لمسة زر متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد كيف يتم عد الخلايا من خلال قناة خاصة ، الدوائر التي تعمل باللمس. الخلايا التي تم عدها من خلال القناة الوحيدة مشرق الميدان ، والتي لا تعبر عن وسيتم مضان دائري باللون الأزرق. هذا يشير إلى أن تلك الخلية خاص هو العيش (أي بي سالب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتبين GFP معربا عن الخلايا في القناة GFP ، وسيتم دائري باللون الأخضر. سيتبين الخلايا الميتة ملطخة الأحمر الميت الخليوي في قناة بي ، وسوف يكون دائريا في الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسيتم فرز الخلايا في القناة على حد سواء أحمر وأخضر دائري باللون الأصفر ، وهذا يشير إلى أن الخلايا عن GFP ، ولكن أيضا مع PI الملون وبالتالي فهو ميت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أحيانا ، الدوائر السوداء سوف تظهر على الشاشة ، وهذه هي الأشياء التي تم تحديدها ، ولكن تم استبعادها من التحليل القائم على حجم الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل فايشمال شرق توليف على عتبة المدرج مضان باستخدام الخطوات الموضحة فقط حتى يتم حلقت كل خلية التي يتم التعبير عن مضان مع اللون المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تلقائيا حفظ جميع المعلمات تحت علامة التبويب تحليل البيانات. يمكن تخزين بيانات عداد الكريات طالي الملفات من تشغيل ما يقرب من 500 عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل الملفات المخزنة في التبويب البيانات المتاحة لإعادة التحليل. وذلك بتحديد ملف من علامة التبويب بيانات يمكن فتحه ورسوم بيانية وجميع طبقات تصبح نشطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأرشفة البيانات وتوليد التقارير ، قد يكون نقل البيانات المخزنة في عداد الكريات إلى كمبيوتر باستخدام محرك أقراص USB. </li></ol> 4. ممثل النتائج : تم استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات لقياس مستوى بروتين فلوري التعبير في الخلايا التي تم transduced مع النووية التي تستهدف بناء BacMam GFP التعبير 2.0. وكانت transduced أربعة أنواع الخلايا ممثل (U2OS ، 293MSR ، HEKn وS - CHO).لهذه خطوط الخلايا ، تم الابلاغ عن عدد من الخلايا التي تم التعبير عن GFP من عداد الكريات تالي وبالمقارنة مع بيانات من نفس العينات على تحليل تدفق عداد الكريات. بالإضافة إلى ذلك ، تم صبغ الخلايا مع كاشف خلية الأحمر الميت باستخدام أدوات لتحديد الجدوى طالي السكان خلية ميتة سواء في عداد الكريات تالي وعلى تدفق عداد الكريات. ورسوما بيانية تظهر في الشكل 2 في المئة من مجموع السكان لكل نوع من الخلايا التي تم التعبير عن GFP. هذه المعطيات تدل على أن عداد الكريات طالي تنتج بيانات قابلة للمقارنة على البيانات التي يولدها تدفق عداد الكريات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig1.jpg" /> الشكل 1. وينبغي أن تركز الخلايا بشكل صحيح قبل التحليل. الشرائح طالي التحليل الخلوي مع تركيزات الخلية المناسبة للتحليل (ينصح 1 × 05-01 أكتوبر 7 × 10 خلايا) (يسار) في تركيز الخلايا د موحدقد يكون قلل الفلك في جميع أنحاء الخلية ، مع هالة مشرقة حول كل خلية خلايا (في الوسط) عند الانتقال بين الخلفية وحواف من الخلايا هي الخلايا غامض وغير معروف لها حدود (يمين) خلايا overcounted ربما عندما يكون لديهم مشرق محيط المراكز والظلام. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3659/3659fig2.jpg" /> الشكل 2. الفلورسنت البيانات بروتين تعبير عن عداد الكريات طالي يستند إلى صورة غير قابلة للمقارنة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام التدفق الخلوي. مقارنة جنبا إلى جنب النتائج GFP التعبير عن محسوب في 4 خطوط مختلفة من الخلايا في الخلايا قابلة للحياة.

<ol>
	<li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy.">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li><li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry.">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis.">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li><li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests.">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li><li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry.">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li><li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture.">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li><li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry.">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li><li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells.">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li></ol>

كريسي Remple وستون لوريل والعاملين في تقنيات الحياة الذي أنتج الأداة المستخدمة في هذه المقالة. وقد رعت الحياة تكنولوجيز إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو.

وقد فصلنا مجرد إجراء لأداء بحساب الجدوى وتقييم التعبير GFP باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات. باستخدام نفس الإجراء ، وهذا هو عداد الكريات قادرة على أداء عدد من فحوصات أخرى ومنها : موت الخلايا المبرمج ، وخلية التحليل RFP جدوى استخدام المنظمات غير transduced الخلايا. أصبحت المقايسات Fluorometric من بقاء الخلية ، والتعبير الجيني والخلايا الرئيسية في منهجيات البحوث الطبية الحيوية 7-12. في الأجهزة ، في الماضي منفصلة تم استخدامها للحصول على معلومات كمية والبصرية حول الخلايا. في حين تم المعلومات الكمية حول الخلايا ضمن مجموعة من السكان غير متجانسة حصل من خلال استخدام التدفق الخلوي ، وقد تم جمع المعلومات المرئية أو نوعية من خلال استخدام المجهر مضان 1-4. هنا ، نقدم التكنولوجيا التي تسد الفجوة بين السكان ودراسات الخلايا الفردية. استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات والكمية داويمكن جمع البيانات وتا الخلايا البصرية حول الخلايا الفردية أو السكان الخلية في وقت واحد. يمكن استخدام أداة طالي لمجموعة من التطبيقات بما في ذلك تقييم التعبير الجيني ، المقايسات موت الخلايا المبرمج ، ودراسات نجاعة الأدوية ، وتقييم تطور المرض. ويستند إلى صورة طالي يلتقط عداد الكريات مشرق وتحليلات ميدانية ، مضان أحمر والصور مضان أخضر ، مما يتيح الحصول على معلومات عن المجموعات السكانية الفرعية من الخلايا. على سبيل المثال ، في هذا الاختبار ، كنا قادرين على التمييز بين الخلايا الميتة من الخلايا الحية داخل GFP ، معربا عن سكان الخلية باستخدام صبغة الأحمر الميت الخلية. وهذا يعطي دقة في قياس خلايا قابلة للحياة معربا عن GFP ، ويحدد عدد السكان من الخلايا يمكن استخدامها لمعالجة المصب. ومن المهم أن نلاحظ أن الخلايا الميتة في عدد السكان يمكن أن تنشأ من مصادر مختلفة ، بما في ذلك موت الخلايا الطبيعية في الثقافة أو موت الخلية الناجمة عن الظروف البيئية (على سبيل المثال ، أو بحكم trypsinizationATH الناجم عن الأسلوب ترنسفكأيشن / تنبيغ المختار). نحن هنا لشرح استخدام عداد الكريات طالي U2OS مع الخلايا. لا يمكن أن يؤديها أساليب مماثلة باستخدام خلايا معظم الثدييات والحشرات. لكل خط الخلية ، أنتجت كمية البيانات عداد الكريات طالي GFP التعبير ، التي هي غير ممكنة مع الفحص البصري من الخلايا باستخدام المجهر مضان القياسية. على الرغم من أن هذه النتائج قابلة للمقارنة مع التدفق الخلوي ، يتم جمعها في جزء من الوقت. في عداد الكريات قادر على الفرز بين الخلايا بدقة 5 ميكرون إلى 60 ميكرون في القطر ، وبشكل مثالي في تركيز 1 × 05-1 أكتوبر الخلايا 7 × 10 / مل. من المهم أن نشير إلى أن معظم البروتوكولات تلطيخ القياسية ، بما في ذلك البروتوكول خلية تلوين الأحمر الميت الموصوفة هنا ، استخدم يوديد propidium للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. هذا يمثل تحديا عند تقييم الجدوى في الخلايا التي تم permeabilized عن شaining علامات داخل الخلايا ، حيث سيكون وصمة عار PI مع أي خلية غشاء خطر. حيث يمكن تحليل أي صبغة الفلورسنت أو البروتين الذي يمكن اكتشافه مع القنوات مضان أخضر أو أحمر على عداد الكريات يستند إلى صورة تالي ، قد الدراسات المستقبلية استكشاف استخدام الأصباغ البديلة ، مثل الأمينات الأصباغ بقاء رد الفعل 4. ووجدت دراسة عام 2006 من قبل وآخرون Perfetto (12). هذه الأصباغ لتكون سهلة الاستخدام وقابلة للتكرار في تمييز السكان الخلية الحية والميتة. علما بأن طالي والقيود فيما يتعلق أنواع المقايسات أنها يمكن أن تؤدي. على سبيل المثال ، لأن الهدف المستخدمة من قبل الصك 4X ، وتقتصر عمليات الفرز على أنواع أكبر خلية : شبه الخلوية هياكل مثل الميتوكوندريا أو حويصلات ، ولا يمكن أن يكون كميا الخلايا البكتيرية. نلاحظ أيضا أن تقتصر قنوات الكشف في تالي إلى fluorophores التي سوف تثير وتنبعث منها داخل القنوات. بينما YFP ومشرق mCherry ج إشاراتيتم الكشف عن ، يمكن باهتة إشارات mCherry لا. أخيرا ، طالي التحليلات فقط الخلايا في التعليق. فإنه لا يحسب بدقة خلايا الانضمام إلى شريحة. وعلاوة على ذلك ، في حين أن هناك قدرة محدودة لفرز الخلايا التي تتشكل بصورة غير نظامية ، بما في ذلك بعض الخمائر والخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، سوف تتناول الدراسات المستقبلية المحتمل استخدام هذا النظام في تقييم التعبير من علامات داخل الخلايا. يمكن التحقق من الأصباغ الفردية للتداخل مع القنوات الطيفية المجاورة ، وذلك باستخدام أداة لInvitrogen SpectraViewer الانترنت ( <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). نظرا لحداثة هذه التكنولوجيا ، ومجموعة كاملة من التطبيقات لم يتم اكتشافها. باختصار ، صورة القائم على طالي عداد الكريات تظاهر هنا يقدم تكنولوجيا جديدة تسمح لتصور في وقت واحد وتحليل للسكان الخلية ، مما يتيح تقييم الخلايا الفردية ، وكذلك سلل السكان في شكل التعاقد مع سير عمل بسيطة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> كاحل يستند إلى صورة عداد الكريات </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> الشرائح كاحل التحليل الخلوي ، 50 الشرائح </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> الشرائح كاحل التحليل الخلوي ، 500 الشرائح </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> كاحل كيت الاستمرارية -- الميت الاحمر الخليوي </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> كاحل كيت الاستمرارية -- الميت الخضراء الخلية </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> كاحل الأبوطوزيس كيت </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> خلايا U2OS </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

ويتم الحصول على عادة وحيدة الخلية والمعلومات السكانية إما عن طريق الفحص المجهري أو التدفق الخلوي مضان. ومع ذلك ، فإن هذه طريقتين تقديم معلومات مختلفة. التدفق الخلوي يعطي كمية متعددة بارامترية من المعلومات حول الخصائص الفيزيائية وتلطيخ أو التعبير ، ولكن لا يسمح التصور. قائمة بذاتها المجهري مضان توفر بيانات مرئية ، لكنها لا تسمح للقياسات الكمية المباشرة 1. الصورة القائمة على الخلوي الجسور الفجوة بين هاتين الطريقتين ، وتمكين التصور سريعة والتحليل الكمي في وقت واحد الالاف من الخلايا في السكان غير متجانسة 2. هنا ، نقدم طريقة لأداء وقابلية الخلية الخضراء الفلورية المقايسات البروتين التعبير (GFP) باستخدام عداد الكريات طالي يستند إلى صورة 3. الصك تالي هو مقايسة الفوق 3 قناة (حقل مشرق ، ومخضر ، مضان أحمر) منصة الخاص بشركةمزايا عديدة عبر التمرير التدفق الخلوي ، والفحص المجهري مضان. في عداد الكريات تالي هو اقل كلفة ، ويأخذ مساحة أقل مقاعد البدلاء ، وتتطلب صيانة أقل ، ولقد تم تبسيط تدفق العمل بحيث العملية والتحليل هو أبسط من ذلك بكثير وأسرع. في عداد الكريات طالي غير قادرة على أداء مجموعة من الخلية المقايسات مقرها التعليق ، بما GFP والحمراء ببروتين التعبير (RFP) ، وموت الخلايا المبرمج 4-6 خلية تحليل الجدوى مع يوديد propidium (PI) 7-11. هنا ، ونحن لشرح استخدام الأداة طالي في أداء مقايسة بقاء الخلية في الخلايا معربا عن GFP. هي ملطخة GFP - transduced الخلايا باستخدام أدوات الاستمرارية طالي -- الميت الاحمر الخلية. وpipetted ثم الخلايا في تحليل طالي الشرائح الخلوية وتحميلها في عداد الكريات. يتم التقاط مجال مشرق ، ومضان أحمر وأخضر مضان الصور وتحليلها باستخدام خوارزميات مقايسة محددة. ثم يتم إنشاء رسوم بيانية لعرض حجم الخلية ، PI fluorescence الكثافة ، وGFP كثافة مضان. ويمكن بعد ذلك أن هذه المعلمات thresholded إلى منزل على السكان في خلية معينة. وجنبا إلى جنب مقارنة من عداد الكريات طالي يستند إلى صورة والتقليدية التدفق الخلوي يدل على أن الطريقتين توفير بيانات قابلة للمقارنة بشأن سلامة الخلية وبروتين تعبير. ومع ذلك ، فإن الصك طالي يوفر معلومات بصرية إضافية حول السكان الخلية التي لا يمكن الحصول عليها باستخدام عداد الكريات التدفق.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

هذا البروتوكول يصف كيفية تنفيذ بقاء الخلية المقايسات والتعبير مضان باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات.

تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

استهدفت التعبير عن GFP في بصيلات الشعر عن طريق خارج الجسم تنبيغ الفيروسية

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

تحليل دورة الخلية الحية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات وVybrant DyeCycle البنفسج الحمض النووي وصمة عار

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...