Name: assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer
Uploaded: 2011-11-17T13:00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

<ol>
	<li>Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementarity+of+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Microscopy.">Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy.</a> Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).</li><li>Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analysis+by+open-source+software+for+affordable+cytometry.">Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry.</a> Scanning. 33, 33-40 (2011).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).</li><li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+apoptosis:+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system.">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-654 (2002).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Koopman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis.">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84, 1415-1420 (1994).</li><li>Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+fluorochromes+to+ethidium+bromide+for+automated+read+out+of+cytotoxicity+tests.">Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests.</a> J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).</li><li>King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+dead+cells+and+measurement+of+cell+killing+by+flow+cytometry.">Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).</li><li>Jones, K. H., Kniss, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+as+a+nuclear+counterstain+for+immunofluorescence+studies+on+cells+in+culture.">Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).</li><li>Dell'Arciprete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+expression+gene+cloning+by+flow+cytometry.">High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry.</a> J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).</li><li>Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+quantitative+and+inexpensive+method+for+detecting+apoptosis+by+flow+cytometry+in+transiently+transfected+cells.">A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).</li><li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li></ol>

Крисси Ремпле и Лорел Камень являются сотрудниками Life Technologies, кто создал прибор, используемый в этой статье. Life Technologies спонсировал производство этого видео-статьи.

Мы только что подробные процедуры для выполнения рассчитывает жизнеспособность и оценки GFP выражение, использующее на основе изображения Тали Цитометр. Используя те же процедуры, это цитометр способен выполнять ряд других анализов в том числе: апоптоз, ППП и жизнеспособность клеток анализ с использованием не-трансдуцированных клеток. Флуорометрические анализов жизнеспособности клеток, экспрессию генов и апоптоз стали ключевыми методологиями в области биомедицинских исследований 7-12. В прошлом, отдельных приборов были использованы для получения количественных и визуальную информацию о клетках. Хотя количественная информация о ячейках в гетерогенной популяции была получил с помощью проточной цитометрии, визуальных и качественная информация была собрана с помощью флуоресцентной микроскопии 1-4. Здесь мы представляем технологию, которая устраняет разрыв между численностью населения и отдельных исследованиях клетки. Использование Тали на основе изображения Цитометр, количественные дата и визуальных данных ячейки об отдельных клеток или клеточных популяций могут быть собраны одновременно. Тали инструмент может быть использован для широкого спектра приложений, включая оценку экспрессии генов, апоптозе анализы, исследования эффективности лекарств, а также оценки прогрессирования заболевания. На основе изображения Тали фиксирует и анализирует Цитометр светлого поля, красная флуоресценция и зеленые флуоресцентные изображения, позволяя информацию о субпопуляции клеток, которые могут быть получены. Например, в этом анализе, мы были в состоянии отличить мертвых клеток у живых клеток в GFP-экспрессирующих клеточной популяции использованием мертвых клеток красного красителя. Это дает точность в измерении жизнеспособных клеток, экспрессирующих GFP, и определяет популяцию клеток пригодные для дальнейшей переработки. Важно отметить, что мертвые клетки в популяции могут возникнуть из различных источников, включая нормальный гибель клеток в культуре или гибель клеток вызвано экологическими условиями (например, трипсинизации или де-ATH индуцированных трансфекции / трансдукции выбранного метода). Здесь показано использование Тали цитометр с клетками U2OS. Подобные методы могут быть выполнены с использованием самых млекопитающих и клетки насекомых. Для каждой клеточной линии, цитометр Тали получены количественные данные GFP выражение, которое не возможно при визуальном осмотре клеток с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа. Хотя эти результаты сопоставимы с проточной цитометрии, они собираются в сжатые сроки. Цитометр способен точно подсчета клетки от 5 мкм до 60 мкм в диаметре, в идеале при концентрации 1 х 10 5 до 1 х 10 7 клеток / мл. Важно отметить, что большинство стандартных протоколов окрашивания, в том числе мертвые клетки Красной протокол окрашивания, описанные здесь, используйте пропидий йодида различать живых и мертвых клеток. Это представляет проблему при оценке жизнеспособности клетки, которые были проницаемыми для гоaining внутриклеточных маркеров, так как П. И. окрасит любую ячейку с угрозой мембраны. Так как любая флуоресцентного красителя или белков, которые могут быть обнаружены с зеленой или красной флуоресценции каналы могут быть проанализированы на Тали на основе изображения Цитометр, будущие исследования могут изучить возможность использования альтернативных красителей, таких как амин активными красителями жизнеспособность 4. 2006 Исследование Perfetto и др. 12. Нашел эти красители должны быть просты в использовании и воспроизводимые в дискриминации живых и мертвых клеточных популяциях. Обратите внимание, что Тали имеет ограничения в отношении типов анализов он может выполнять. Например, с целью используется инструмент 4X, считая операций ограничены в более крупные типы клеток: субклеточных структур, таких как митохондрии или пузырьки, и бактериальные клетки не могут быть определены количественно. Также отметим, что обнаружение каналов в Тали ограничиваются флуорофоров, что будет волновать и излучают в пределах каналов. Хотя YFP и яркие mCherry сигналы сбыть обнаружен, диммер mCherry сигналы не могут. Наконец, Тали только анализ клеток в суспензии. Это не будет точного подсчета клетки придерживаясь слайда. Более того, пока есть лишь ограниченные возможности для подсчета клеток, неправильной формы, в том числе дрожжей и первичных ячеек. Кроме того, будущие исследования, скорее всего, рассмотрены вопросы использования этой системы в оценке выражения внутриклеточных маркеров. Индивидуальные красители могут быть проверены на спектральные совпадают с соседних каналов, с помощью онлайн-инструмент SpectraViewer Invitrogen (в <a href="http://www.invitrogen.com/spectraviewer">www.invitrogen.com / spectraviewer</a> ). Учитывая новизну этой технологии, полный спектр применения до сих пор не обнаружены. Таким образом, Тали на основе изображения Цитометр продемонстрировали здесь представляет новую технологию, которая позволяет одновременно визуализации и анализа клеточных популяций, что позволяет оценки отдельных клеток, а также челл населения в компактном формате с простой рабочий процесс.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Тали на основе изображения Цитометр </td><td> Invitrogen </td><td> T10796 </td></tr><tr><td> Тали Сотовая Анализ Слайды, 50 слайдов </td><td> Invitrogen </td><td> T10794 </td></tr><tr><td> Тали Сотовая Анализ Слайды, 500 слайдов </td><td> Invitrogen </td><td> T10795 </td></tr><tr><td> Тали Жизнеспособность Kit - Dead Red Cell </td><td> Invitrogen </td><td> A10786 </td></tr><tr><td> Тали Жизнеспособность Kit - Dead зеленую клетку </td><td> Invitrogen </td><td> A10787 </td></tr><tr><td> Тали Апоптоз Kit </td><td> Invitrogen </td><td> A10788 </td></tr><tr><td> U2OS клетки </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of gfp expression and viability using the tali image-based cytometer

Одно-клеток и демографической информации, как правило, получают либо проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Однако, эти два метода дают разную информацию. Проточная цитометрия дает количественную многопараметрических информацию о физических характеристиках и окрашивание или выражение, но не позволяет для визуализации. Автономные флуоресцентной микроскопии обеспечивает визуальные данные, но не допускает простых количественных измерений 1. Изображение основе цитометрии мост через пропасть между этими двумя методами, что позволяет быстро визуализации и одновременного количественного анализа тысяч клеток в гетерогенной популяции 2. Здесь мы представляем метод для выполнения жизнеспособности клеток и зеленый флуоресцентный белок (GFP) анализы выражения с помощью Тали на основе изображения Цитометр 3. Инструмент Тали 3-канальный (светлое поле, зеленая флуоресценция, красная флуоресценция) настольный анализа платформу, которая ОффеRS несколько преимуществ по сравнению с проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Цитометр Тали дешевле, занимает меньше места на столе, требует меньше технического обслуживания, и рабочий процесс был упрощен настолько, что операция и анализ намного проще и быстрее. Цитометр Тали способен выполнять ряд суспензии клеток основе анализов, в том числе GFP и красный флуоресцентный белок (RFP) выражение, апоптоз 4-6 и жизнеспособность клеток анализ с йодистым пропидий (PI) 7-11. Здесь мы демонстрируем использование Тали инструментом в проведении анализа жизнеспособности клеток в клетках, экспрессирующих GFP. GFP-трансдуцированных клетки окрашивали Kit Тали Жизнеспособность - Dead Red Cell. Затем клетки пипеткой в ​​анализ Слайд Тали Сотовые и загружается в цитометр. Светлое поле, красной флуоресценции и зеленые флуоресцентные изображения будут захвачены и проанализированы с помощью специальных алгоритмов анализа. Гистограммы Затем генерируется для отображения размера ячейки, П. И. флуоресценциифлуоресценции интенсивности и интенсивность флуоресценции GFP. Эти параметры могут быть затем thresholded для перехода к конкретной популяции клеток. Бок о бок сравнение Тали на основе изображения Цитометр и традиционных проточной цитометрии показывает, что два метода дают сопоставимые данные о жизнеспособности клеток и экспрессии белка. Тем не менее, инструмент Тали обеспечивает дополнительную визуальную информацию о популяции клеток, которые не могут быть получены с помощью проточного цитометра.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer at JoVE.com

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Этот протокол описывает, как выполнить жизнеспособности клеток и флуоресцентных анализов выражения с помощью Тали на основе изображения Цитометр.

Оценка GFP слова и жизнеспособность использование Тали на основе изображения Цитометр

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Целевые Экспрессия GFP в волосяной фолликул Использование Ex Vivo Вирусный трансдукция

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Подсчет голосов и определение жизнеспособности культивируемых клеток

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Жить анализ клеточного цикла<em&gt; Drosophila</em&gt; Тканей с использованием акустической Attune Фокусировка Цитометр и Vybrant DyeCycle Фиолетовое пятно ДНК

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Измерение скорости обмена веществ в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; С помощью респирометрии

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...