Name: dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

De auteurs willen dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Centrum, Berlijn) bedanken voor zijn behulpzame opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de collaborative research centrum (SFB665) van de Duitse Research Council (DFG).

1. Dissection procedure Let op: Experimenteel gebruik van muizen moeten officieel goedgekeurd te volgen richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. <ol><li> Voor de voorbereiding, het opzetten van uw dissectiemicroscoop en lay-out van de chirurgische instrumenten die nodig is voor dissectie waaronder grote en kleine schaar, grote tanden tang, gebogen pincet en vier sets van Dumont No.5 ontleden pincet (waarvan er twee binnen-gepolijst tips) ( voor details zie de...

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Stereotiepe projectie patronen bestaande uit beide types van axonale tak formatie samen met het gemak van voorbereiding in combinatie met het gebruik van vaste weefsel voor DII etikettering maakt de embryonale ruggenmerg met aangebouwde DRG een gunstige model om te studeren axonale vertakkingen. De toepassing van minieme hoeveelheden van Dii gebruik van gecoat glas naalden laat - in tegenstelling tot het grootste deel etikettering van DRG - het visualiseren van kleine groepen van DRG neuronen en daarmee de analyse van i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar (optioneel) </td></tr><tr><td> Stereomicroscoop Stemi DRC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfaat-gebufferde oplossing (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L 182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standaard chirurgische schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Getande standaard tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fijn iris schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen pincet </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 fijne tips tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 spiegel afwerking tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen veer schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filtreerpapier </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Wereld Precission Instruments </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm petrischaaltjes </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12-ml polypropyleen buis </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-well plaat cultuur </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Bruin micropipet trekker P-97 </td><td> Sutter Instrument Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicaatglas haarvaten </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> Dii (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethyl - indocarbocyanine perchloraat) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Objectglaasjes SuperFrost Plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen dekglaasjes </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Hier presenteren wij een techniek om de trajecten van kleine groepen van DRG neuronen label in de embryonale ruggenmerg door diffuse kleuring met behulp van de lipofiele tracer 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DII) 1 . De vergelijking van axonale routes van wild-type met die van de muis lijnen in welke genen gemuteerd kunnen testen voor een functionele rol van de kandidaat-eiwitten in de controle van axonale vertakkingen, die is een essentieel mechanisme in de bedrading van het zenuwstelsel. Axonale vertakkingen in staat stelt een individueel neuron te verbinden met meerdere doelen, waardoor het verstrekken van de fysische basis voor de parallelle verwerking van informatie. Gevolgen bij tussentijdse doelstelling regio&#39;s van axonale groei kan worden onderscheiden van terminal arborization. Bovendien kunnen verschillende vormen van axonale tak formatie worden ingedeeld, afhankelijk van de vraag of vertakking resultaten van de activiteiten van de groei kegel (splitsen of vertraagd behanching) of bij het ​​ontluiken van de zekerheden van het axon as in een proces genaamd interstitiële vertakking 2 (afb. 1). De centrale projecties van de neuronen van de DRG bieden een nuttige experimenteel systeem op beide soorten van axonale vertakkingen studie: als hun afferente axonen bij de dorsale wortel entry zone (DREZ) van het ruggenmerg tussen embryonale dag 10 tot 13 (E10 - E13) zij weer een stereotype patroon van T-of Y-vormige splitsing. De twee resulterende dochter axonen dan verder in rostrale of caudale richtingen, respectievelijk aan de dorsolaterale marge van het koord en pas na een wachttijd collateralen ontspruiten uit deze stam axonen naar de grijze stof (interstitiële vertakking) en het project door te dringen tot relay neuronen in specifieke laminae van het ruggenmerg, waar ze verder arborize (terminal vertakking) 3. Dii traces hebben uitgewezen groei kegels op de dorsale wortel entry zone van het ruggenmerg die leek te zijn in de process van het splitsen van wat suggereert dat bifurcatie wordt veroorzaakt door het splitsen van de groei conus zelf 4 (afb. 2), echter, hebben andere opties besproken en 5. Deze video toont eerst hoe te ontleden het ruggenmerg van muizen E12.5 het verlaten van de DRG aangesloten. Na fixatie van het monster kleine hoeveelheden van Dii worden toegepast op de DRG met behulp van glas naalden getrokken uit capillaire buizen. Na een incubatie stap, is de gelabelde ruggenmerg gemonteerd als een omgekeerde open boek, voorbereiding op de individuele axonen met behulp van fluorescentie microscopie te analyseren.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

De stereotiepe projecties van de zintuiglijke afferenten in het ruggenmerg knaagdier bieden een gemakkelijk toegankelijk experimenteel systeem om axonale vertakkingen door het opsporen van enkele axonen studie.

Dii-Etikettering van de DRG neuronen om Study Axonale Vertakkingen in een hele berg Voorbereiding van muis embryonale ruggenmerg

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Hele Mount Voorbereiding van de Adult Drosophila Ventraal Nerve Fiber Koord voor Giant Dye Injectie

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...