Name: dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center di Berlino) per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal centro di ricerca collaborativa (SFB665) del Consiglio di ricerca tedesco (DFG).

1. Dissezione procedura Nota: l&#39;uso sperimentale di topi dovrebbe seguire ufficialmente approvato le linee guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. <ol><li> Prima della preparazione, impostare il microscopio da dissezione e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione tra cui forbici grandi e piccole, grandi pinza dentata, pinze curve e quattro set di Dumont n.5 dissezione pinze (di cui due con dentro-lucido punte) ( Per i dettagli si veda la t...

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Modelli stereotipati di proiezione che comprende entrambi i tipi di formazione ramo assonale insieme a facilità di preparazione, in combinazione con l&#39;uso di tessuto fissato per Dii etichette rende il midollo spinale embrionale con allegato un modello DRG favorevole per lo studio assonale ramificazione. L&#39;applicazione di piccole quantità di Dii con aghi di vetro rivestito permette - in contrasto con l&#39;etichettatura maggior parte dei DRG - la visualizzazione di piccoli gruppi di neuroni DRG e quindi l&#39;a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio Stemi RDC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard di forbici chirurgiche </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dentata pinze di serie </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra forbici iris multa </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 multa suggerimenti pinze </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 finitura a specchio forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs-Tübingen primavera forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro di carta </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Mondo precission Instruments </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm Petri </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml di tubo in polipropilene </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-lastra e cultura </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipetta estrattore P-97 </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive SuperFrost Plus. </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro di copertura scivola </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Qui vi presentiamo una tecnica per etichettare le traiettorie di piccoli gruppi di neuroni DRG nel midollo spinale embrionale dalla colorazione diffusivo utilizzando il tracciante lipofilo 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . Il confronto di percorsi assonale di wild-type con quelli di topi in cui sono mutati i geni consente di testare per un ruolo funzionale delle proteine ​​candidato nel controllo della ramificazione degli assoni che è un meccanismo essenziale per il cablaggio del sistema nervoso. Assonale ramificazione permette ad un singolo neurone per connettersi con bersagli multipli, fornendo così le basi fisiche per l&#39;elaborazione parallela di informazioni. Ramificazioni in regioni obiettivo intermedio di crescita assonale può essere distinto da arborizzazione terminale. Inoltre, diverse modalità di formazione ramo assonale possono essere classificati a seconda che i risultati ramificazione delle attività del cono di crescita (splitting o reggiseno in ritardonching) o lo sbocciare di collaterali dal pozzo assone in un processo chiamato interstiziale ramificazione 2 (Fig. 1). Le proiezioni centrali dei neuroni dal DRG offrire un utile sistema sperimentale per studiare entrambi i tipi di ramificazione assonale: quando i loro assoni afferenti raggiungere la dorsale zona di ingresso principale (DREZ) del midollo spinale embrionale tra i giorni 10-13 (E10 - E13) che visualizzare un modello stereotipato di T-o Y biforcazione. I due assoni figlia risultante quindi procedere in direzione rostrale o caudale, rispettivamente, al margine dorsolaterale del midollo e solo dopo un periodo di attesa collaterali germogliano da queste assoni staminali di penetrare la materia grigia (interstiziale ramificazione) e il progetto di neuroni in specifiche relè lamine del midollo spinale, dove ulteriori arborize (ramificazione terminale) 3. Tracciati DII hanno rivelato coni di crescita nella zona dorsale voce principale del midollo spinale che sembrava essere in process della scissione suggerendo che biforcazione è causata dalla scissione del cono di crescita in sé 4 (Fig. 2), tuttavia, altre opzioni sono state discusse anche 5. Questo video dimostra come prima di sezionare il midollo spinale dei topi E12.5 lasciare il DRG allegato. A seguito di fissazione degli importi piccolo campione di DII vengono applicati a DRG con aghi di vetro tirato da tubi capillari. Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale è montato etichettato come un libro aperto rovesciato preparazione di analizzare i singoli assoni usando la microscopia a fluorescenza.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Le proiezioni stereotipata di afferenze sensoriali nel midollo spinale di roditori offrire un sistema facilmente accessibile sperimentale per studiare ramificazione degli assoni attraverso il tracciamento degli assoni singolo.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomia e impianto della finestra del cavo spinale nel mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...