Name: dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) for nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av forskningssamarbeid sentrum (SFB665) av den tyske Research Council (DFG).

1. Disseksjon prosedyre Merk: Eksperimentell bruk av mus bør følge offisielt godkjent retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr. <ol><li> Før forberedelse, sette opp dissecting mikroskop og legge ut den kirurgiske instrumenter som trengs for disseksjon, inkludert store og små saks, store toothed tang, buet tang og fire sett med Dumont No.5 dissecting tang (hvorav to har inside-polert tips) ( for detaljer, se tabell over spesifikke reagenser og utstyr). Plasser et ark med...

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Stereotype projeksjon mønstre bestående av begge typer aksonal grenen formasjon sammen med enkel tilberedning i kombinasjon med bruk av fast vev for DII merking gjør embryonale ryggmargen med festet DRG en gunstig modell for å studere aksonal branching. Anvendelsen av små mengder av DII bruke belagt glass nåler gir - i motsetning til mesteparten merking av DRG - visualisering av små grupper av DRG nevroner og derved analyse av individuelle axoner og deres forgreninger mønstre. De beskrevne metoden kan bli ytterl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Stereomikroskop STEMI DRC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat-bufret løsning (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard kirurgisk saks </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Tannet standard tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Ekstra fint iris saks </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Buet tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 fint tips tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 speil finish tang </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs-Tübingen våren saks </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filter papir </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Verden Precission Instrumenter </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm petriskåler </td><td> Greiner </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12-ml polypropylen rør </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-godt kultur plate </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown mikropipette puller P-97 </td><td> Sutter Instrument Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borsilikatglass kapillærer </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-Tetramethyl - indocarbocyanine perklorat) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> Objektglass SuperFrost Plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Glass dekkglass </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Her presenterer vi en teknikk for å merke baner av små grupper av DRG nerveceller i den embryonale ryggmargen ved diffusive flekker bruke lipofile tracer 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII) 1 . Sammenligningen av aksonal pathways av vill-type med de av mus linjer i hvilke gener som er mutert muliggjør testing for en funksjonell rolle kandidat proteiner i kontroll av aksonal forgrening som er en viktig mekanisme i ledningene av nervesystemet. Aksonal forgrening muliggjør en individuell neuron å koble til med flere mål, og dermed gir det fysiske grunnlaget for parallell prosessering av informasjon. Forgreninger på mellomliggende mål regioner av aksonal veksten kan skilles fra terminal arborization. Videre kan forskjellige moduser av aksonal gren dannelsen bli klassifisert avhengig av om forgreninger resultater fra virksomheten av veksten kjeglen (splitte eller forsinket BHnching) eller fra den spirende av collaterals fra axon akselen i en prosess som kalles interstitiell branching 2 (Fig. 1). Den sentrale projeksjoner av nerveceller fra DRG tilby et nyttig eksperimentelt system for å studere begge typer aksonal forgrening: når deres afferent axons nå dorsal root entry zone (DREZ) av ryggmargen mellom embryonale dager 10 til 13 (E10 - E13) de vise et stereotypt mønster av T-eller Y-formet bifurcation. De to resulterende datteren axoner deretter fortsette i rostral eller caudal retninger, henholdsvis ved dorsolateral margin på ledningen og bare etter en venteperiode collaterals spirer fra disse stammer axons å trenge inn i grå substans (interstitiell forgrening) og prosjekt til stafett nevroner i spesifikke lameller av ryggmargen der de videre arborize (terminal branching) 3. DII Sporing har avdekket vekst kjegler på dorsale roten oppføring sone i ryggmargen som syntes å være i process av splitting foreslå at bifurcation er forårsaket av splitting av veksten kjeglen selv 4 (Fig. 2), har imidlertid andre alternativer vært diskutert så vel 5. Denne videoen viser først hvordan å dissekere ryggmargen av E12.5 mus å forlate DRG vedlagt. Etter fiksering av prøven ørsmå mengder DII brukes til DRG bruke glass nåler trukket fra kapillarrør. Etter en inkubasjonstid trinn, er den merket ryggmargen montert som en omvendt åpen bok forberedelse til å analysere enkelte axons med fluorescens mikroskopi.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Den stereotype projeksjoner av sensoriske afferenter til gnager ryggmargen tilby en lett tilgjengelig eksperimentelt system for å studere aksonal branching gjennom sporing av enkelt axoner.

DII-Merking av DRG Neurons til Study aksonal Avgrening i en hel Mount Utarbeidelse av Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indusert ryggmargsskade Model å vurdere Mekanismer av aksonal degenerasjon i sanntid

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

sebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Forberedelse til Elektrofysiologiske Opptak fra Spinal sensoriske og motoriske nevroner

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projeksjonsmønsteret av Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminectomy og vindus kabel i mus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Utarbeidelse av akutt ryggmargen skiver for hele celle Patch-klemme opptak i Substantia Gelatinosa nerveceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...