Name: dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) för värdefulla kommentarer. Detta arbete stöddes av forskningssamarbete centrum (SFB665) av den tyska forskningsrådet (DFG).

1. Dissection förfarande OBS: Experimentell användning av möss bör följa officiellt godkända riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. <ol><li> Innan förberedelse, ställa in dissekera mikroskop och lägga ut de kirurgiska instrument som behövs för dissektion, inklusive stora och små saxar, stora tandade pincett, böjda pincett och fyra uppsättningar av Dumont No.5 dissekera pincett (varav två har inne-polerat tips) ( för detaljer se tabell specifika rea...

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

Stereotypa projektion mönster som består av både typerna av axonal gren bildas tillsammans med enkel beredning i kombination med användning av fasta vävnad för DII märkning gör embryonala ryggmärgen med bifogade DRG en gynnsam modell för att studera axonal förgrening. Tillämpningen av små mängder av DII använda belagt glas nålar låter - i motsats till huvuddelen märkning av DRG - visualisering av små grupper av DRG nervceller och därmed analys av enskilda axoner och deras förgrening mönster. Den be...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Stereomikroskop STEMI Demokratiska republiken Kongo </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbuffrad lösning (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Merck </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Standard kirurgisk sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.001-13 </td><td></td></tr><tr><td> Tandad standard pincett </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.021-14 </td><td></td></tr><tr><td> Extra fin iris sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Böjd pincett </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.003-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 fina tips tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 spegelglansyta tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-Tübingen våren sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.008-08 </td><td></td></tr><tr><td> Filterpapper </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Världen Precission Instrument </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100-mm petriskålar </td><td> Greiner </td><td> 663.102 </td><td></td></tr><tr><td> 12-ml polypropylen rör </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12-väl odlingsplatta </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Merck </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brun mikropipett avdragaren P-97 </td><td> Sutter Instrument Co </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas kapillärer </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DII (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetrametyl - indocarbocyanine perklorat) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468.495 </td><td></td></tr><tr><td> Objektglas SuperFrost Plus </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> Glas täckglas </td><td> Carl Roth GmbH </td><td> 1870,2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

Här presenterar vi en teknik för att märka banor små grupper av DRG nervceller i embryonala ryggmärgen med diffusionsprovtagare färgning med lipofila spårämne 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII) 1 . Jämförelsen av axonal vägar av vild-typ med dem av mus linjer i vilka gener som är muterade kan testa en funktionell roll kandidat proteiner i kontrollen av axonal förgrening vilket är en grundläggande mekanism i ledningar i nervsystemet. Axonal förgrening gör att en enskild neuron att ansluta med flera mål, vilket ger den fysiska grunden för parallell bearbetning av information. Förgreningar till delmål regioner axonal tillväxt kan skiljas från terminalen arborization. Dessutom kan olika typer av axonal gren bildas klassificeras beroende på om förgreningar resultat från verksamheten i tillväxt konen (delning eller försenas behånnching) eller från spirande av säkerheter från axonet axeln i en process som kallas interstitiell förgrening 2 (Fig. 1). Den centrala projektioner av nervceller från DRG ett användbart experimentellt system för att studera båda typerna av axonal förgrening: när deras afferenta axoner når dorsala zonen roten inträde (DREZ) i ryggmärgen mellan embryonala dagar 10 till 13 (E10 - E13) de visa ett stereotypt mönster av T-eller Y-formade bifurkation. De två resulterande dottern axoner fortsätter sedan i rostralt eller caudal riktningar, respektive vid dorsolaterala marginal på sladden och först efter en väntetid säkerheter Spirande dessa härrör axoner att tränga in i den grå massan (interstitiell förgrening) och projekt för relä nervceller i specifika lamell av ryggmärgen där de ytterligare arborize (plint förgrening) 3. DII tracings har visat tillväxt kottar på dorsala posten zon av ryggmärgen som föreföll vara i process att dela upp tyder på att bifurkation orsakas av uppdelning av tillväxten konen i sig 4 (Fig. 2) har dock andra alternativ diskuterats och 5. Denna video visar först hur att dissekera ryggmärg från E12.5 möss lämnar DRG bifogas. Efter fixering av provet små mängder av DII tillämpas på DRG med glas nålar dras från kapillärrör. Efter en inkubationstid steg är märkt ryggmärgen monteras som en inverterad öppen bok förberedelse för att analysera enskilda axoner med fluorescensmikroskopi.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Den stereotypa projektioner av sensoriska afferenter till gnagare ryggmärgen erbjuda ett lättillgängligt experimentellt system att studera axonal förgrening genom spårning av enskilda axoner.

Dii-märkning av DRG nervceller att Studera axonal Förgrening i en hel Mount Beredning av Mouse Embryonala ryggmärg

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

Visualisering av embryonala nervsystemet i hela-fäste Drosophila Embryon

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Hela berget Beredning av vuxna Drosophila På magen Nerve Snodd till Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-inducerad ryggmärgsskada modell för bedömning Mekanismer axonal degeneration i realtid

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Förberedelse för elektrofysiologiska inspelningar från Spinal sensoriska och motoriska nervceller

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projektionsmönstret av Embryonic Motor Neurons in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Implantation av laminektomi och Ryggmärgs fönster i musen

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Beredning av akut ryggmärgen skivor för hela-cell Patch-clamp inspelning i Substantia Gelatinosa nervceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...