Name: isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion
Uploaded: 2012-06-29T12:00:00
Duration: 7 min 39 s
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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 DK05823 (para RGW), F32 DK083213 (para JWW), F30 DK081265 (para ALO), e por uma concessão do Fred e Biesecker Suzanne Liver Center Pediátrica (para RGW).

Todo o procedimento é realizado à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. 1. Preparação de soluções enzimáticas <ol><li> Preparam-se soluções de enzimas de acordo com a Tabela 1 e estéreis, utilizando um filtro de 0,22 um filtro. Manter a solução 1 e solução 2, à temperatura ambiente e uma solução de 3 a 4 ° C até ao momento de utilização. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células isoladas devem ser estéreis. </li></ol> 2. Preparação da máquina de perfusão <ol><li> Primeiro o sistema de perfusão com HBSS menos Ca 2 + / Mg 2 +, que foi aquecido a 37 ° C. Nota: Para assegurar que o perfusato é de 37 ° C, quando chega ao fígado, HBSS é aquecida num banho de água ajustado para 37 ° C. Depois ela passa através da bomba de perfusão, ele passa por um condensador de vidro encamisado que está ligado a um conjunto circulador de água a 40 ° C (Fig. 1). </li><li> Esterilizar cirúrgico paraóis em um copo com etanol a 70%. </li></ol> 3. Perfusão do Fígado <ol><li> Anestesiar um adulto de rato Sprague-Dawley machos por injecção intraperitoneal de Nembutal (50-100 peso corporal mg / kg, conforme necessário para se obter anestesia adequada). </li><li> Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma bandeja de plástico e corrigir os membros para a bandeja com fita adesiva. </li><li> Limpe o abdômen com EtOH 70%. </li><li> Fazer uma pequena incisão na pele sobre o abdómen na linha média. Dissecar a pele para longe do painel frontal por meio de corte em forma de U grande no abdómen. Cortar o músculo abdominal com uma tesoura na sequência da mesma forma para expor a cavidade peritoneal. </li><li> Expor a veia porta usando 2 cotonetes para mover suavemente as vísceras abdominais para o lado direito. </li><li> Passe duas suturas de seda estéril 2.0 debaixo da veia porta e gravata frouxa. </li><li> Canular a veia porta com um cateter calibre 16-18 IV e fixe o cateter no lugar apertando a ti vagamentesuturas ed a partir do passo anterior (Fig. 2). </li><li> Injectar heparina diluída através do cateter IV (1 ml de unidades de heparina 5000 USP / ml diluído com 4 ml de HBSS menos Ca 2 + / Mg 2 +). O fígado deve branquear. </li><li> Ligue o cateter IV para o sistema de perfusão. Perfundir com HBSS menos Ca 2 + / Mg + 2 a uma taxa de 20 ml / min durante 10 minutos. O transecto IVC inferior ao fígado para permitir a drenagem do sangue e do perfusato. Aspirar sangue reunidas a partir da cavidade abdominal. </li><li> Alterar o fluido de perfusão a uma solução de colagenase 0,3% (150 mg de colagenase tipo 2 em 500 ml HBSS mais Ca 2 + / Mg 2 +) e perfundir durante 25 minutos. Manter a umidade do fígado, cobrindo-o com o retalho previamente dissecados abdominal. Colocar uma tampa placa de Petri sobre a aba abdominal ea posição de uma lâmpada de calor sobre a área a manter a temperatura intra-abdominal, aproximadamente 37 ° C. </li></ol> 4. Preparação do diae árvore biliar <ol><li> Remover o fígado, levantando-o para fora da cavidade abdominal com uma pinça e colocá-lo num prato de cultura de tecido estéril preenchido com L-15 de Leibovitz frio meios de comunicação. </li><li> Trabalhando na capa cultura de tecidos, descascar a cápsula hepática e gentilmente burlar o parênquima hepático além com uma pinça. Mova o fígado através de vários pratos cheios de L-15 Liebovitz de mídia, enquanto continua a provocar longe do parênquima, até que finalmente saiu com a árvore biliar isolado. O parênquima hepático é castanhos claros, enquanto o restante da árvore biliar é branco. </li><li> Coloque a árvore biliar isolado num tubo Falcon 50 ml cheia com 10 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml de penicilina e 10.000 ug / ml de estreptomicina); deixar em gelo durante 15 minutos. </li></ol> 5. Isolamento da fracção de Fibroblasto Portal <ol><li> Coloque a árvore biliar em um tubo de 50 ml estéril falcão e triture com tesoura estéril. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de enzima solution # 1 para dentro do tubo (cerca de 5 ml) e continuar a picar a árvore biliar até atingir a consistência de uma massa pastosa. </li><li> Verter a suspensão em um frasco de vidro estéril. Lavar a tubo de falcão com a restante solução # 1, depois despejar o frasco de vidro. Incubar a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante 30 minutos. </li><li> Filtra-se a suspensão através de um copo coberto com uma única camada de malha de nylon (30-micron de tamanho de poro). </li><li> Transferir todo o tecido restante no topo da malha para uma garrafa de vidro estéril por lavagem da malha com solução de enzima # 2. Iniciar vertendo meia (25 ml) da solução para um prato 15 centímetros estéril Petri. Cuidadosamente remover a malha a partir do copo, segurando as bordas da malha sem contaminar a área central, em seguida, invertendo a malha e mergulhando-o na solução numa placa de Petri para remover qualquer tecido restante na malha. Descarte a malha. Transferir a solução numa placa de Petri em um frasco de vidro estéril. Lavar a placa de Petri com o remaIning 25 ml de solução # 2 e transferi-lo para a garrafa de vidro mesmo. Incubar a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante 30 minutos. </li><li> Enquanto isso, tome-se o filtrado no copo e despeje em um tubo falcon 50 ml. Centrifugar a 1600 rpm (460 x g) durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar meios de comunicação e ressuspender o pellet em 25 ml de solução de # 3. </li><li> Tome a solução do passo 5.5 e filtrá-lo para um copo de segunda estéril coberto com 30 mícrons de malha. </li><li> Descarte a malha. Centrifugar o filtrado a 1600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aspirar e ressuspender o sedimento com 25 ml de solução de # 3, como foi feito no passo 5.7. </li><li> Combinar as fracções de 2 a partir de passos 5.7 e 5.9 e centrifugar de novo a 1600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar meios de comunicação e ressuspender o pellet em 10 ml de meio de cultura de portal de fibroblastos (DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS, fungizona 1% de penicilina / estreptomicina, gentamicina 0,3%, e 0,2%). </li><li> Contar as células para a viabilidade da placa em pratos de cultura de tecidos. Dependendo da aplicação desejada, de 0,5 a 5 x 10 células por 6 10-cm placa de cultura de tecido são adequados. De um rato Sprague-Dawley adultos, que tipicamente obter 2 a 10 milhões de células viáveis. </li><li> Substituir os meios de cultura, no dia seguinte para remover os detritos não-aderente. Em seguida, substitui os meios de cultura a cada 2 dias. </li></ol> 6. Os resultados representativos Primárias fibroblastos de portal isoladas de fígado de rato adulto são mostrados em 1, 3 e 7 dias após o isolamento (Fig. 3). Note-se que as células são alongados, com morfologia típica de fibroblastos. As células podem ser coradas com anti-elastina anticorpo (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) para confirmar a pureza. Fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em cultura. Isto pode ser demonstrado por imunocoloração para α-actina de músculo liso (α-SMA; A2547, Sigma, St. Louis, MO). <tableborder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Solução de colagenase 0,3% </td><td> Colagenase tipo 2 </td><td> 150 mg </td></tr><tr><td> HBSS com Ca2 + / Mg2 + </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td rowspan="7"> Solução # 1 (Pronase) </td><td> Albumina de soro bovino </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td> Colagenase tipo 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 18 mg </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Solução # 2 </td><td> Albumina de soro bovino </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td rowspan="6"> (Hialuronidase) </td><td> Colagenase tipo 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> 22 mg </td></tr><tr><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solução # 3 </td><td> DNase </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Soluções enzimáticas. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig1.jpg" /> Figura 1. Perfusão configurar. A. Circulação de água para a coluna de aquecimento. Coluna B. contendo mídia de perfusão. C. torneira controlar saída da bomba. D. Bomba entrada. E. bomba peristáltica de velocidade variável. F. frasco de vácuo com Bio-Clean detergente. G. lâmpada de calor. Água H. banho para a mídia de perfusão aquecimento. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig2.jpg" /> FIGUre 2. perfusão in situ. A. Cateter IV inserido na veia portal, fixada com sutura e ligado à tubagem de perfusão através torneira. B. vidro pipeta ligado ao frasco de vácuo e de sucção de parede para remover líquido de perfusão de drenagem de seccionado VCI. Intestinos I.. L. Fígado. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig3.jpg" /> Figura 3. De contraste de fase e imunofluorescência mancha de fibroblastos de rato de portal em cultura. Fibroblastos Portal cultivadas durante 1, 3 e 7 dias após o isolamento foram fixadas e coradas para a elastina, α-SMA e DAPI.

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	<li>Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+-+like+cells+and+liver+fibrogenesis:+Emerging+concepts+in+a+rapidly+moving+scenario.">Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario.</a> Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).</li><li>Dranoff, J. A., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+fibroblasts:+Underappreciated+mediators+of+biliary+fibrosis.">Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis.</a> Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).</li><li>Tuchweber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat.">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74, 265-278 (1996).</li><li>Beaussier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominent+contribution+of+portal+mesenchymal+cells+to+liver+fibrosis+in+ischemic+and+obstructive+cholestatic+injuries.">Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries.</a> Lab Invest. 87, 292-303 (2007).</li><li>Kinnman, N., Housset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peribiliary+myofibroblasts+in+biliary+type+liver+fibrosis.">Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis.</a> Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).</li><li>Kinnman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myofibroblastic+conversion+of+peribiliary+fibrogenic+cells+distinct+from+hepatic+stellate+cells+is+stimulated+by+platelet-derived+growth+factor+during+liver+fibrogenesis.">The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis.</a> Lab Invest. 83, 163-173 (2003).</li><li>Uchio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+retinol-binding+protein-1+expression+and+modulation+during+in+vivo+and+in+vitro+myofibroblastic+differentiation+of+rat+hepatic+stellate+cells+and+portal+fibroblasts.">Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts.</a> Lab Invest. 82, 619-628 (2002).</li><li>Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+rat+liver+fibroblasts.">Isolation of primary rat liver fibroblasts.</a> J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+and+substrate+stiffness+regulate+portal+fibroblast+activation+in+culture.">Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture.</a> Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).</li><li>Bosselut, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+proteomic+features+of+two+fibrogenic+liver+cell+populations:+hepatic+stellate+cells+and+portal+myofibroblasts.">Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts.</a> Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).</li><li>Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecto-nucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase+NTPDase2/CD39L1+is+expressed+in+a+novel+functional+compartment+within+the+liver.">The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver.</a> Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Fibroblastos de portal desempenhar um papel importante na fibrose biliar. Descrevemos aqui uma modificação do protocolo original publicada por Kruglov e Dranoff 8 para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato, proporcionando uma maneira simples para estudar esta população de células in vitro. Esta abordagem utiliza a digestão da protease e baseada no tamanho de filtração. A principal vantagem do método é que uma população relativamente pura de células podem ser obtidas sem a passagem em cultura, permitindo que o estudo da expressão do gene ou o comportamento de células funcional vários dias após o isolamento. Esta técnica também oferece o potencial para isolar células de fígados saudáveis ​​e doentes. Uma das etapas mais críticas neste protocolo é a digestão enzimática do parênquima hepático. Para assegurar uma digestão sucesso, é importante para confirmar que o sangue é completamente drenado para fora do fígado durante o perfusão inicialSion, certificando-se que há ainda de branqueamento do fígado. Para facilitar isto, é possível usar um cotonete para massagem suave do fígado, enquanto perfundindo. Mais de digestão de os resultados parênquima hepático em um baixo rendimento de células viáveis, enquanto sob a digestão-irá tornar mais difícil separar o parênquima do fígado a partir da árvore biliar. Desde os preparativos de pronase tem variabilidade na atividade enzimática entre diferentes lotes, a otimização da quantidade utilizada pode ser necessária quando há baixa produção de células viáveis. Este protocolo pode ser modificada para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato ou do fígado de ratos jovens usando uma menor bitola cateter IV para canular a veia portal, diminuindo o volume das soluções de perfusão em proporção ao peso do animal, e diminuindo a taxa de perfusão do fígado e cerca de 10 ml / min. Fibroblastos em cultura de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em 10-14 dias, como evidenciado por α-SMA expressão 9. Vários marcadores têm sido utilizados para distinguir os fibroblastos de portal a partir de células estreladas hepáticas, incluindo fibulin-2, IL-6, elastina, nucleósido-trifosfato difosfohidrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteínas neuronais, tais como sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Nós descobrimos que a elastina é um bom marcador para fibroblastos de portal, mesmo após a diferenciação miofibroblástico, enquanto NTPDase2 é perdido após fibroblastos de portal tenham sido submetidos a cultura, após vários dias 9. Portanto, nós tipicamente confirmar o isolamento de fibroblastos portal pela técnica de imunofluorescência para elastina. A limitação desta técnica é que, imediatamente após o isolamento de fibroblastos de portal, existe uma pequena fracção de contaminar células incluindo células de Kupffer e células biliares. Fibroblastos de portal outgrow estas células contaminantes dentro de 2-3 dias, no entanto, obtendo-se uma população relativamente puro (&gt; 98%) 9. Since fibroblastos do portal de cultura sofrem diferenciação miofibroblástico em plástico de cultura de tecido, que normalmente estudar estas células dentro de 7 dias de isolamento. As células são mantidas em meios de fibroblastos de portal de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, como descrito na secção Métodos. No entanto, estas células irão sobreviver no meio de crescimento contendo 2% de soro fetal de bovino durante vários dias. Nós normalmente não usam meios de baixo custo de soro até pelo menos 24 horas após o isolamento. Uma vez que os fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico, eles podem ser passadas várias vezes e mantidos como stocks congelados de miofibroblastos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Colagenase tipo 2 </td><td> Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) </td><td> LS004177 </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche (Indianapolis, IN) </td><td> 70290120 </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> Sigma (St. Louis, MO) </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Desoxirribonuclease </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen (Carlsbad, CA) </td><td> 11320 </td></tr><tr><td> HBSS sem Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech (Manassas, VA) </td><td> 21-021-CM </td></tr><tr><td> HBSS com Ca2 + / Mg2 + </td><td> Mediatech </td><td> 21-020-CM </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gêmeos Bio (West Sacramento, CA) </td><td> 900-108 </td></tr><tr><td> Malha de nylon Nitex de 30 uM </td><td> Genesee Científica (San Diego, CA) </td><td> 57-105 </td></tr></tbody></table>

isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion

Fibrose hepática é definida pela deposição excessiva de matriz extracelular por miofibroblastos activados. Existem múltiplas de precursores miofibroblastos hepáticas, incluindo as células estreladas hepáticas, fibroblastos de portal e medula óssea fibroblastos derivados 1. Células estreladas hepáticas ter sido melhor estudada, mas fibroblastos portal estão cada vez mais reconhecidos como importantes contribuintes para a piscina de miofibroblastos, particularmente na fibrose biliar 2. Fibroblastos de portal sofrer proliferação em resposta a uma lesão epitelial biliar, potencialmente desempenhando um papel fundamental nos estágios iniciais da cicatrização biliar 3-5. Um método de isolamento de fibroblastos de portal permitiria estudo in vitro desta população de células e conduzir a uma maior compreensão do papel fibroblastos de portal desempenhar na fibrose biliar. Fibroblastos de portal foram isolados utilizando várias técnicas, incluindo excrescência 6, 7 e liperfusão ver com a digestão enzimática seguida de seleção de tamanho 8. A vantagem da digestão e técnica de selecção de tamanho em comparação com a técnica excrescência é que as células podem ser estudados sem a necessidade de passagem em cultura. Aqui, nós descrevemos uma versão modificada da técnica original descrita por Kruglov e Dranoff 8 para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato, que resulta em uma população relativamente pura de células primárias.

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Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Uma técnica para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato é descrito. Os fígados são perfundidos e digerido<em&gt; In situ</em&gt; Com colagenase, seguido por<em&gt; Ex vivo</em&gt; Digestão da lama de fígado e de selecção do tamanho das células. Este método proporciona uma população pura de fibroblastos de portal sem a necessidade de passagem em cultura.

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

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