Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לקית&#39; ל Knutson מסוזן ג&#39;קומן לקרן קיור וNIH / NCI 9R01 CA152045 וP50-CA116201.

<ol>
	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

הייצור והגישה חופשי של מאמר וידאו זה ממומן על ידי אבחון רוש.

CD8 תאי T חשובים לתגובה החיסונית אדפטיבית, להיות מסוגל להרוג תאים נגועים או ממאיר ישירות 4. אמנם יש כמה דרכים למדוד את המספרים של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים (למשל ELISPOT, tetramer, cytometry זרימה), לעתים קרובות זה עוזר לדעת אם תאים אלה הם רעילים לתאים 3 מבחינה תפקודית. Assay המוכר ביותר להערכת תפקוד ציטוטוקסיות הוא CRA, אשר נחשב 4 assay תקן זהב. מגבלות עיקריות של CRA הן (1) הדרישה של רדיואקטיביות, (2) חוסר הרגישות, (3) חוסר מידע מכניסטית, (4) דרישה לכמויות גדולות של תאים, ו( 5) להגדיר מייגע. וכך, בעשור האחרון, יש כבר עניין באימוץ אסטרטגיות חדשות כדי למזער את המגבלות האלה. חדש יותר גישות כוללים את אלה שמידת caspase שחרור 4, BLT ולין activity5, ומשטח ביטוי של CD107 6. כתב היד הנוכחית מצביעה על כךassay עכבה מבוסס, שבוצע במערכת xCelligence רוש, עשוי להיות שימושי כאלטרנטיבה לCRA גם. היכולת להתאים את גישת עכבה מבוססת נשענת על התצפית כי תאי T, אשר אינם נצמדים בחוזקה למשטחים, לא נראה שיש לי הרבה השפעה על עכבה וכך הולכת ופוחתת בכל חשש להתערבות ישירה של תאי T עם המדידה. העבודה הנדרשת לשימוש במערכת assay העכבה צפויה להיות נמוך באופן משמעותי בעיקר בשל חיסול החששות הרגולטוריות לשימוש בקרינה רדיואקטיבית. החסרון הבולט היחיד של המערכת מבוססת עכבה הוא שהשקעה של 50,000 $ ל 60,000 $ נדרשת לרכישה של יחידת xCelligence. עם זאת, יחידת xCelligence מבטלת את הצורך במונה קרינה והוא הרבה יותר תכליתי, להיות שימושי להערכת תגובה תאית לסמים והגירה, בנוסף לתא T cytotoxicity 8. התצפיות שההפחתה בעכבת גידול תא היא תלויה מינון, כמתואר באיור 2, עם מדרון תלול למדי בעקבות פונקציה ריבועית משנית פשוטה מצביע על כך שassay יכול לשמש בהגבלת מבחני דילול (LDAs) כדי לאמוד את השכיחות של תאים ציטוטוקסיות 9 . יתרון אחד עם הגישה מבוססת עכבה הוא כי מספר תאי T ותאים הסרטניים הנדרשים הוא פחות מ CRA, מה שהופך LDA פוטנציאל ריאלי יותר. לדוגמה, בCRA, ביחס 1:40, 1 x 10 5 תאים סרטניים בכל טוב הם מצופים אשר דורש 4 x 10 6 תאי T סך בכל טוב. עם זאת, בassay עכבה מבוסס, רק 1.5 x 10 4 תאים סרטניים בכל טוב יש צורך, אשר צורך רק 6 x 10 5 תאי T סך בכל טוב. לפיכך, assay עכבה מבוסס משתמש 85% פחות תאי T ותאים סרטניים. הפחתה זו מצביעה על כך שהמערכת מבוססת עכבה יכולה להיות מותאמת לניטור חיסוני בניסויים קליניים בבני אדם שבו לאהוא שואב את הכרכים של דם עשוי להיות מוגבלים. כמו כן, בעוד CRA מוגבל לנקודת זמן אחת, assay עכבה מבוסס אוסף בזמן אמת נתונים רציפים, המאפשר למשתמש להשוות נקודות זמן תמוגה מרובות על אותו הניסוי עם עבודה נוספת מינימאלית ותאים. חישובי תדר שעלולים להיות בשילוב עם אסטרטגיות אחרות שלא מודדות פונקציה כגון ניתוחי tetramer להקים את היחס בין תאי T ציטוטוקסיים פונקציונליים לCD8 אנטיגן ספציפיים לכלל תאי T 10. אחת התכונות המושכות ביותר של הגישה מבוססת עכבה הוא כי, בניגוד לרוב מבחני אחרים, יכול להיות במעקב cytotoxicity בזמן אמת, שעלול להיות מה שמקל כדי לחקור אינטראקציות סלולריות עם השימוש במעכבים או נוגדנים. נוסף הוא שהשיטה עשויה להיות מתאימה לתאים סרטניים עמיד בפני תיוג. לבסוף, מאחר שהתאים הסרטניים שאינם נהרגו אינם מסומנים ויישארו סטרילי מסיק נוסף, ומחקר של תאי תא העמידים T הוא possibLe. לסיכום, בעוד שתי המערכות לספק נתונים הרג סרטניים בתגובה לתאי T הספציפיים, assay עכבה מבוסס הוא רגיש יותר מCRA ומספק פלטפורמה גמישה יותר.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

ציטוטוקסיות CD8 תאי T מהווים תת קבוצה של תאי T שהם מסוגלים גרימת המוות של תאי מארח 1 נגוע או ממאיר. תאים אלה מבטאים קולטן מיוחד, הנקרא קולטן תא T (TCR), שיכול לזהות פפטיד אנטיגני ספציפי חייב HLA כיתה אני מולקולות 2. אירוסין של תאים נגועים או תאים סרטניים באמצעות התוצאות שלהם HLA Class I המולקולה בייצור של מולקולות ממסות כגון granzymes וperforin וכתוצאה מכך המוות של תאי היעד. למרות שזה שימושי לקביעת תדרים של אנטיגן ספציפי לתאי T CD8 באמצעות מבחני כגון cytometry ELISPOT או זרימה, זה גם מועיל לברר את כוחו של CD8 T תגובות תא באמצעות מבחני cytotoxicity 3. Assay המוכר ביותר להערכת תפקוד ציטוטוקסיות הוא Assay שחרור הכרום (CRA), שנחשב 4 assay סטנדרטי. יש CRA מספר מגבלות, כולל חשיפה של תאים לקרינת גמא, LACK של שחזור, ודרישה למספר גדול של תאים. במהלך העשור האחרון, יש כבר עניין באימוץ אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על המגבלות האלה. חדש יותר גישות כוללים את אלה שמידת caspase שחרור 4, BLT פעילות ולין 5 ומשטח ביטוי של CD107 6. Assay עכבה מבוסס, באמצעות מערכת xCelligence רוש, נבחן בנייר הנוכחי לפוטנציאל שלו כאלטרנטיבה לCRA. עכבה או התנגדות לזרם חשמלי מתרחשת כאשר תאים סרטניים חסיד להיקשר לצלחות אלקטרודה. תאים סרטניים להינתק בעקבות הרג ועכבה חשמלית מופחתת הניתן למדידה על ידי מערכת xCelligence. היכולת להתאים את הגישה מבוססת עכבה להעריך הרג תא בתיווך נשענת על התצפית שתאי T לא לדבוק באופן הדוק על רוב המשטחים ולא נראה שיש לי הרבה השפעה על עכבה וכך הולכת ופוחתת בכל חשש להתערבות ישירה של תאי T עםהמדידה. תוצאות מראות כי assay עכבה מבוסס יכול לזהות שינויים ברמות של CD8 תאי T ציטוטוקסיים אנטיגן ספציפי עם רגישות מוגברת ביחס לCRA הסטנדרטי. בהתבסס על תוצאות אלו, עכבה מבוססת גישות עשויות להיות חלופות טובות לCRAs או גישות אחרות שמטרתם למדוד את הפונקציונליות ציטוטוקסיות CD8 T תא.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Assay שחרור הכרום, assay משותף לאיתור פעילות תא T ציטוטוקסי, יש מספר מגבלות. השימוש באנטיגן ספציפי CD8 תאי T וקו האנושי של סרטן שד גידול, SKBR3, במאמר הנוכחי, גישה מבוססת עכבה נבדקה ליכולת של גילוי הרג תא.

קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian<sup&gt; +</sup&gt; T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...