Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a Keith L. Knutson dalla Susan G. Komen per la Fondazione Cure e NIH / NCI 9R01 CA152045 e P50-CA116201.

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Produzione e del libero accesso di questo video-articolo è sponsorizzato da Roche Diagnostics.

Cellule T CD8 sono importanti per la risposta immunitaria adattativa, essendo in grado di uccidere direttamente le cellule infette o maligne 4. Mentre ci sono diversi modi per misurare il numero di cellule antigene-specifiche T CD8 (es. ELISPOT, tetramero, citometria a flusso), spesso è utile sapere se queste cellule sono funzionalmente citotossico 3. Il test più riconoscibile per la valutazione della funzione citotossica è il CRA, che è considerato il gold standard 4 test. Le principali limitazioni del CRA sono (1) il requisito della radioattività, (2) la mancanza di sensibilità, (3) la mancanza di informazioni relative alla meccanica, (4) necessità di grandi quantità di cellule, e (5) set up laborioso. Così, negli ultimi dieci anni, c&#39;è stato interesse ad adottare nuove strategie per ridurre al minimo queste limitazioni. Recenti approcci comprendono quelli che misura caspasi release 4, BLT esterasi activity5, e l&#39;espressione di superficie di CD107 6. Il presente manoscritto suggerisce cheil saggio impedenza-based, eseguito sul sistema xCELLigence Roche, può anche essere utile come alternativa al CRA. La capacità di adattare l&#39;approccio impedenza basato poggia sulla constatazione che le cellule T, che non aderiscono perfettamente alle superfici, non sembrano avere molto impatto sulla impedenza diminuendo così qualsiasi preoccupazione di interferenza diretta delle cellule T, con la misura. La manodopera necessaria per l&#39;utilizzo del sistema di dosaggio impedenza dovrebbe essere significativamente meno soprattutto dovuto all&#39;eliminazione delle preoccupazioni regolamentari per l&#39;uso di radioattività. L&#39;unico svantaggio notevole del sistema di impedenza-based è che un esborso di $ 50.000 a $ 60.000 è richiesto per l&#39;acquisto dell&#39;unità xCELLigence. Tuttavia, l&#39;unità xCELLigence elimina la necessità di un contatore di radiazioni ed è molto più versatile, essendo utile per valutare la risposta cellulare ai farmaci e migrazione oltre alla citotossicità delle cellule T 8. Le osservazioni chela diminuzione dell&#39;impedenza cellula tumorale è dose-dipendente, come illustrato nella figura 2, con una pendenza ripida ragionevolmente seguendo una semplice funzione quadratica secondaria suggerisce che l&#39;analisi può essere utilizzato in saggi di diluizione limitante (ADL) per stimare la frequenza di cellule citotossiche 9 . Un vantaggio con l&#39;approccio basato impedenza è che il numero di cellule T e cellule tumorali necessaria è inferiore al CRA, rendendo LDA potenzialmente più fattibile. Ad esempio, nel CRA, con un rapporto di 01:40, 1 x 10 5 cellule tumorali per pozzetto sono placcati che richiede 4 x 10 6 cellule T totale per pozzetto. Tuttavia, nel saggio impedenza-based, sono necessari solo 1,5 x 10 4 cellule tumorali per pozzetto, che consuma solo 6 x 10 5 cellule T totale per pozzetto. Così, il saggio impedenza-based utilizza cellule T 85% in meno e cellule tumorali. Questa riduzione suggerisce che il sistema basato impedenza potrebbe essere adattato al monitoraggio immunologico in studi clinici umani dove tegli volumi di prelievi di sangue può essere limitato. Inoltre, mentre il CRA è limitata a un singolo punto di tempo, il saggio impedenza basata raccoglie continue dati in tempo reale, permettendo all&#39;utente di confrontare più punti di tempo di lisi sullo stesso esperimento con il lavoro aggiuntiva minima e cellule. Calcoli di frequenza potrebbe potenzialmente essere combinati con altre strategie che non misurano la funzione, come le analisi tetramero di stabilire il rapporto tra cellule T citotossiche funzionali al totale antigene-specifiche cellule CD8 T 10. Una delle caratteristiche più interessanti di questo approccio impedenza-based è che, a differenza di molti altri saggi, citotossicità può essere monitorato in tempo reale, rendendo potenzialmente più facile studiare interazioni cellulari con l&#39;uso di inibitori o anticorpi. Un altro è che il metodo può essere adatto per le cellule tumorali che resistono etichettatura. Infine, dato che le cellule tumorali non-morti non sono etichettati e rimangono sterili, ulteriore raccolta e lo studio delle cellule cellule resistenti T è possibLe. In sintesi, mentre entrambi i sistemi forniscono dati uccisione tumorali in risposta a specifiche cellule T, il saggio impedenza-based è più sensibile del CRA e fornisce una piattaforma più flessibile.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Citotossici CD8 cellule T costituiscono un sottogruppo di cellule T che sono in grado di indurre la morte delle cellule ospiti infettate o maligne 1. Queste cellule esprimono un recettore specializzato, chiamato il recettore delle cellule T (TCR), che può riconoscere uno specifico peptide antigenico legato a molecole HLA di classe 2. Impegno delle cellule infette o cellule tumorali attraverso i loro HLA di classe I risultati molecola nella produzione di molecole litici quali granzimi e perforina con conseguente morte delle cellule bersaglio. Mentre è utile per determinare la frequenza di cellule antigene-specifici T CD8 usando saggi come il ELISPOT o citometria a flusso, è anche utile per accertare la forza della risposta delle cellule T CD8 usando saggi di citotossicità 3. Il saggio più riconoscibile per la valutazione della funzione citotossica è il saggio di rilascio di cromo (CRA), che è considerato un saggio standard di 4. Il CRA ha diverse limitazioni, tra cui esposizione delle cellule a radiazioni gamma, lack di riproducibilità, e un requisito per un gran numero di cellule. Negli ultimi dieci anni, c&#39;è stato interesse ad adottare nuove strategie per superare queste limitazioni. Recenti approcci comprendono quelli che misura caspasi release 4, BLT attività esterasi 5 e l&#39;espressione di superficie di CD107 6. Il saggio impedenza-based, utilizzando il sistema xCELLigence Roche, è stata esaminata nel presente documento per il suo potenziale come alternativa al CRA. Impedenza o opposizione ad una corrente elettrica si verifica quando le cellule tumorali aderenti legano alle piastre di elettrodi. Le cellule tumorali si staccano a seguito di uccisione e impedenza elettrica è ridotto, che può essere misurata con il sistema xCELLigence. La capacità di adattare l&#39;approccio impedenza-based per valutare uccisione cellulo-mediata si basa sulla constatazione che le cellule T non aderiscono saldamente alla maggior parte delle superfici e non sembrano avere molto impatto sulla impedenza diminuendo così qualsiasi preoccupazione di interferenza diretta delle cellule T conla misurazione. Risultati mostrano che il saggio impedenza-based può rilevare cambiamenti nei livelli di cellule T antigene-specifiche citotossici CD8 con una maggiore sensibilità relativa allo standard CRA. Sulla base di questi risultati, gli approcci basati impedenza possono essere buone alternative alle agenzie di rating o altri approcci che mirano a misurare la funzionalità citotossica delle cellule T CD8.

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Il saggio di rilascio di cromo, un test comune per rilevare l&#39;attività delle cellule T citotossiche, ha diversi limiti. Utilizzando cellule T CD8 antigene-specifici e la linea tumorale umano cancro al seno, SKBR3, nel presente articolo, un approccio basato impedenza è stata esaminata per la capacità di rilevare uccisione delle cellule.

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

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