Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações para Keith L. Knutson da Susan G. Komen for the Cure Foundation e NIH / NCI 9R01 CA152045 e P50-CA116201.

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Produção e acesso gratuito deste vídeo-artigo é patrocinado pela Roche Diagnostics.

As células T CD8 + são importantes para a resposta imune adaptativa, sendo capaz de matar directamente as células infectadas ou malignas 4. Embora haja várias maneiras de medir o número de células específicas de antigénio de células T CD8 (por exemplo, ELISPOT, tetrero, citometria de fluxo), muitas vezes, é útil saber se estas células são funcionalmente citotóxico 3. O ensaio mais reconhecível para a avaliação da função citotóxica é o PCR, o qual é considerado o 4 de ensaio padrão de ouro. As principais limitações do PCR são: (1) o requisito de radioactividade, (2) a falta de sensibilidade, (3) falta de informação mecanicista, (4) para o requisito de grandes quantidades de células, e (5) acima conjunto trabalhoso. Assim, ao longo da última década, tem havido um interesse na adoção de novas estratégias para minimizar essas limitações. Mais recentes abordagens incluem aqueles que medem caspase release 4, BLT esterase activity5 e expressão de superfície de CD107 6. O presente manuscrito sugere queo ensaio com base na impedância, executadas no sistema de xCELLigence Roche, podem também ser úteis como uma alternativa para a PCR. A capacidade de se adaptar a abordagem baseada em impedância baseia-se na observação de que as células T, que não aderem firmemente às superfícies, não parecem ter muito impacto sobre impedância diminuindo, assim, qualquer preocupação de interferência direta das células T com a medição. A mão de obra necessária para a utilização do sistema de ensaio da impedância deve ser significativamente menos principalmente devido à eliminação das preocupações regulamentares para a utilização de radioactividade. A única desvantagem notável do sistema baseado na impedância é que um dispêndio de $ 50.000 a $ 60.000 é necessária para a aquisição da unidade de xCELLigence. No entanto, a unidade xCELLigence elimina a necessidade de um contador de radiação e é muito mais versátil, sendo útil para avaliar a resposta celular aos medicamentos e à migração, além de citotoxicidade de células T 8. As observações de quea diminuição na impedância de células de tumor é dependente da dose, como ilustrado na Figura 2, com uma inclinação relativamente acentuada na sequência de uma função quadrática simples secundário sugere que o ensaio pode ser utilizado em ensaios de diluição limitante (ADLs) para estimar a frequência de células citotóxicas 9 . Uma vantagem da abordagem baseada em impedância é que o número de células T e células tumorais exigido é inferior ao CRA, tornando LDA potencialmente mais viável. Por exemplo, na PCR, a uma razão 1:40, 1 x 10 5 células por poço tumorais são banhados que necessita de 4 x 10 6 células T totais por poço. No entanto, no ensaio baseado em impedância, são necessários apenas 1,5 x 4 10 células tumorais por poço, que consome apenas 6 x 10 5 células T totais por poço. Deste modo, o ensaio baseado em impedância utiliza 85% menos células T e as células tumorais. Esta redução indica que o sistema à base de impedância pode ser adaptado para monitorização imunológica em ensaios clínicos em humanos em que tele volumes de sangue chama pode ser limitada. Além disso, enquanto que a PCR se limita a um único ponto de tempo, o ensaio baseado em impedância recolhe dados contínua em tempo real, permitindo ao utilizador comparar vários pontos de tempo de lise no mesmo experimento com um mínimo de trabalho adicional e células. Cálculos de frequência poderia ser combinado com outras estratégias que não medem função como tetrâmero análises para determinar a proporção de células T citotóxicas ao total funcionais específicos para o antigénio das células T CD8 10. Uma das características mais atraentes da abordagem baseada na impedância é que, ao contrário da maioria dos outros ensaios, citotoxicidade pode ser monitorado em tempo real, o que poderia tornar mais fácil para estudar as interações celulares com o uso de inibidores ou anticorpos. Outra é que o método pode ser adequado para as células de tumor que resistem a rotulagem. Finalmente, uma vez que as células tumorais não são mortas não marcado e permanece esterilizado, mais colheita e estudo das células T de células resistentes é possívle. Em resumo, embora ambos os sistemas fornecem tumorais matam dados em resposta a células T específicas, o ensaio baseado em impedância é mais sensível do que o PCR e proporciona uma plataforma mais flexível.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

As células T citotóxicas CD8 constituem um subgrupo de células T que são capazes de induzir a morte das células hospedeiras infectadas ou malignas 1. Estas células expressam um receptor especializado, chamado o receptor de células T (TCR), que reconhece um péptido antigénico específico ligado a moléculas de HLA de classe I 2. Acoplamento de células infectadas ou células tumorais, através das suas molécula de HLA de classe I resulta na produção de moléculas líticas, tais como perforina e granzimas, resultando na morte de células alvo. Embora seja útil para determinar a frequência de células específicas para o antigénio T CD8 + utilizando ensaios tais como o ELISPOT ou citometria de fluxo, também é útil para determinar a força de respostas de células T CD8 + utilizando ensaios de citotoxicidade 3. O ensaio mais reconhecível para a avaliação da função citotóxica é o ensaio de libertação de crómio (PCR), que é considerado um ensaio padrão 4. A PCR tem várias limitações, incluindo a exposição de células a radiação gama, lack de reprodutibilidade, e um requisito para um grande número de células. Ao longo da última década, tem havido um interesse na adoção de novas estratégias para superar essas limitações. Mais recentes abordagens incluem aqueles que medem caspase release 4, BLT atividade esterase 5 e expressão de superfície de CD107 6. O ensaio à base de impedância, utilizando o sistema de xCELLigence Roche, foi examinada no presente documento, para o seu potencial como uma alternativa para a PCR. Impedância ou oposição a uma corrente eléctrica ocorre quando as células tumorais aderentes ligam a placas de eléctrodos. As células tumorais separar após abate e impedância eléctrica é reduzida, o que pode ser medido pelo sistema xCELLigence. A capacidade de se adaptar a abordagem baseada em impedância para avaliar a morte mediada por células, baseia-se na observação de que as células T não aderem bem à maioria das superfícies e que não parecem ter grande impacto na impedância diminuindo assim qualquer preocupação de interferência directa das células T coma medição. Os resultados mostram que o ensaio à base de impedância pode detectar alterações nos níveis de células T citotóxicas CD8 + específicas para o antigénio, com sensibilidade aumentada em relação ao padrão de PCR. Com base nesses resultados, as abordagens baseadas em impedância podem ser boas alternativas para CRAs ou outras abordagens que visam medir a funcionalidade das células T CD8 citotóxico.

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

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