Name: determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag till Keith L. Knutson från Susan G. Komen för Cure Foundation och NIH / NCI 9R01 CA152045 och P50-CA116201.

Ett. Generering av kortfristiga humant antigen-specifika CD8 T-cellinjer 7 <ol><li> Separata perifera mononukleära blodceller (PBMC) från blod av normala friska HLA-A2-positiva donatorer med hjälp av Ficoll-Paque Plus. </li><li> Tillsätt 2 ml / brunn av PBMC till 6-brunnars plattor med 2 x 10 6 celler / ml. </li><li> Lägg HLA-A2-bindande HER-2/neu p369-377 peptid (aminosyrasekvens KIFGSLAFL) eller HLA-A2-bindande influensa P58-66 peptid (GILGFVFTL) direkt till brunnarna vid en slutlig koncentration av 10 mikrogram / ml och plats i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. </li><li> För att hjälpa stimulera och expandera T-celler, lägga till, var två dagar, 250 | il / brunn färskt medium kompletterat med humant rekombinant IL-2 (lager: 50 enheter / | il) för att uppnå en slutlig koncentration av 50 enheter / ml i odlingsmediet. </li><li> Re-stimulera kultur celler med 2 x 10 6 celler / ml bestrålade autologa PBMC pulserade i 2 timmar med 10 mikrogram / ​​ml av samma peptider använderd i steg 1,3 och lägg dessa celler till kulturer vid 1 ml / brunn en vecka efter den första peptiden stimulering. </li><li> Lägg humana rekombinanta IL-2 och färska medier, som beskrivs i steg 1,4, i de existerande kulturerna var 2 dagar. </li><li> Beträffande-stimulera cellerna med peptid-och bestrålade autologa PBMC såsom beskrivits i steg 1.5 en vecka efter den andra peptiden stimulering. </li><li> Förbered dig på att använda celler sex dagar efter den sista re-stimulering tidigast. </li></ol> 2. Framställning av bröstcancerceller <ol><li> Placera xCELLigence impedans mätstation (xCELLigence station) i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2. </li><li> Harvest humana tumörceller (SKBR3, BT20, MCF7 eller HCC1419) som är 75% sammanflytande med användning av 0,25% trypsin och centrifugering (1000 rpm under 5 minuter). </li><li> Räkna tumörceller med en hemocytometer och rekonstituera dem i RPMI tumör medium (kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 500 enheter / mlIFN-gamma) vid en koncentration av 7,5 x 10 3 tumör celler/100 | il. </li><li> Programmera xCELLigence programvaran genom att sätta upp layouten för att bestämma väl layout och genom att inrätta schemat för att ta impedans läsningar var 5 minuter för en 40 timmars period. För de första 18 timmarna, kommer xCELLigence systemet ta impedans läsningar av tumörcellerna bara. </li><li> Lägg 100 | il RPMI tumör media till xCELLigence E-plattor och utför en bakgrund läsning genom mätning impedansen i frånvaro av celler. </li><li> Lägg tumörceller till E-plattorna vid 100 ^ per brunn och plats i xCELLigence stationen. </li><li> Tryck på startknappen på xCELLigence programvara för att börja ta impedans läsningar av tumörcellerna, vilket omedelbart börja följa till E-plattorna. </li></ol> Tre. Co-kultur av tumör med CD8 T-celler <ol><li> När tumörcellerna har fäst och fördubblats till 1,5 x 10 4 tumörceller per brunn (cirkacirka 18 timmar efter att initialt är pläterade), skörd T-celler framställs i avsnitt 1 av försiktig skrapning och agitation </li><li> Centrifugera vid 1000 rpm under 5 minuter och räkna T-celler med användning av en hemocytometer och rekonstituera dem i RPMI-medium med 10% FBS vid olika förhållanden, med början vid ett maximalt förhållande av en tumörcell till 40 T-celler och späd 2-faldigt tills ett förhållande av en tumörcell till 1,25 T-celler har uppnåtts. Till exempel finns det 1,5 x 10 4 tumörceller per brunn. För att uppnå en 1:40 förhållande, tillsätt 6 x 10 5 T-celler per brunn och späd T-cellerna 2-faldigt tills ett förhållande av 1,5 x 10 4 tumörceller till 1,875 x 10 4-T-celler per brunn (1:1,25 förhållande) uppnås. </li><li> Pausa xCELLigence stationen och ta bort e-plattan. </li><li> Ta bort materialet i brunnarna med en pipett och tillsätt 200 | il medium enbart eller det lämpliga förhållandet av T-celler till brunnarna. </li><li> Placera E-plattan tillbaka i xCELLigence stationen och fortsätta pro xCELLigence programvaragram så impedans avläsningar görs var 5 minuter för ca 20 timmar efter T-cell tillägg. </li><li> Normalisera resultaten i slutet av analysen. </li></ol> 4. Kromfrisättningsanalys (CRA) 7 <ol><li> Följ institutionella förfaranden strålsäkerheten när du arbetar med 51 Cr och 51 Cr-märkta målceller. Använd alltid lämplig avskärmning för att minska exponeringen för strålning. </li><li> Pulse tumörceller för 2 timmar vid en x 10 6 tumörceller / ml med 10 ^ il / ml färsk 51 Cr (0,005 Ci / ml). </li><li> Tvätta tumörceller i 10 ml RPMI-medium med 10% FBS och centrifugera vid 1000 rpm under 5 minuter. Lägg tumörceller till en 96-brunnars rundbottnad platta vid 1 x 10 5 tumörceller i 100 | il / brunn. </li><li> Lägg T-celler vid olika förhållanden, med början på en tumörcell till 40 T-celler och späd 2-faldigt tills ett förhållande av en tumörcell till 1,25 T-celler har uppnåtts. Till exempel finns det ett x 10 5 tumörceller<html> per brunn. För att uppnå en 1:40 förhållande, tillsätt 4 x 10 6 T-celler per brunn och späd T-cellerna 2-faldigt tills ett förhållande av 1 x 10 5 tumörceller till 1,25 x 10 5 T-celler per brunn (1:1,25 förhållande) uppnås. </li><li> Lägg spontana och maximal tumörceller kontroller till plattan. För att beräkna den spontana frisättningen av 51 Cr från tumörcellerna, tillsätt sex brunnar vardera innehållande 1 x 10 5 tumörceller i 100 | il till 100 | il av RPMI-medium med 10% FBS. För att beräkna maximal frisättning av 51 Cr från tumörcellerna, tillsätt sex brunnar vardera innehållande 1 x 10 5 tumörceller i 100 | il till 100 | il 0,1% Triton X-100 i PBS, som lyserar alla celler. </li><li> Inkubera plattorna under 5 timmar vid 37 ° C med 5% CO2. </li><li> Efter inkubation, ta bort 50 ìl av supernatanten från varje brunn och lägga till en Luma platta. </li><li> Torka plattorna över natten och mäta CPM användning av en gammaräknare. </li></ol>le &quot;&gt; 5. Procent lys Beräkning <ol><li> Impedans analys: Ta impedansen läsning, redovisas som cellen index (CI), vid olika tidpunkter och använder följande formel för att bestämma procent lys: (CI tumör endast - (CI tumör + T-celler)) / (CI tumör endast) * 100. </li><li> CRA: Använd följande formel för att bestämma procent lys: (CPM experimentell - CPM spontant) / (CPM max - CPM spontant) * 100. </li></ol> 6. Representativa resultat T-celler ensamma inte ökar impedansen T-celler, i allmänhet, följer inte de flesta fasta ytor och inte kräver anslutning för aktivering och proliferation. Därför antogs det att T-celler bör inte bidra till impedansen på xCELLigence E-plattor. För att testa detta, var brunnar laddad med antingen SKBR3 bröstcancerceller eller nyligen renade humana CD8 T-celler. Impedans mättes under loppet av 40 timmar och ett representativt exempel demonstrating väsentligen liten effekt av T-celler visas i figur 1A. Däremot skulle det kunna hävdas att T-celler kan minska bakgrunden impedans, om än bara något. Trots detta avslöjade samodling att processen att lägga T-celler vid 18 timmar efter initiering av impedansmätningar resulterade i en impedans avbrott (Figur 1B). Andra studier har visat att störningar berodde delvis på hanteringen eftersom minskningen i signalen skulle kunna minskas genom att säkerställa att temperaturen hos den T-cell-innehållande lösningen på samma sätt som det inre av inkubatorn. Minskningar i impedans som medieras av T-celler är dosberoende. Användbarheten av en impedans-baserad analys för att jämföra prover för cytotoxisk T-cellsaktivitet förutsätter en förmåga att skilja mellan olika koncentrationer av antigen-specifika T-celler. För att testa om det är möjligt, var SKBR3 celler co-odlade med varierande koncentrationtioner av T-celler härledda från en HER-2/neu p369-specifika T-cellinje. Såsom visas i figur 2A, observerades minskningar i impedans beroende av dosen av T-celler. Figur 2B visar att cellen index vid 10 timmar följa en enkel andra ordningens polynomial över området av T-celler. Sålunda övervakar xCELLigence stationen CD8 T död cellmedierad av SKBR3 tumörer i realtid som en droppe i cell index. Impedansen-baserad analys detekterar antigen-specifika T-celler För att bestämma om man minskar impedansen av SKBR3, vilket är ett HER-2/neu och HLA-A2-positiv bröstcancer tumörcellinje, genom HER-2/neu p369-specifika T-celler var antigenspecifika, separata brunnar innehållande SKBR3 inkuberades också med T-celler härledda från en influensa (FLU)-specifik T-cellinje. Influensan specifika-T-celler fungerade som en icke-specifik kontroll, vara HLA-A2-positiva, men inte har någon förmåga att känna igen HER-2/neu. Såsom visas i Fi-gur 3, finns det en signifikant skillnad mellan den lytiska aktiviteten hos HER-2/neu p369-specifika T-celler jämfört med FLU-specifika T-celler (p &lt;0,0001). I vissa fall kan T-celler inte specifika för tumör (t.ex. FLU-specifik eller anti-CD3/anti-CD28 stimulerad) visade en låg nivå av lytisk aktivitet (figurerna 3A-B). T-celler kan döda på ett av två sätt, antingen ospecifikt genom Fas: interaktioner Fas-ligand eller antigen-specifikt genom frisättning av granzymes och perforins. För att ytterligare bekräfta föreställningen att HER-2/neu-specific T-celler dödade i ett antigen-specifikt sätt, införlivade vi en blockerande antikropp till Fas-ligand. Såsom visas i fig. 3B, har antikroppen minskar inte den lytiska aktiviteten hos den HER-2/neu p369-specifika T-celler. Antikroppen kan hämma växelverkan mellan Fas och Fas-ligand, vilket framgick med T-celler som var icke-specifikt aktiveras med anti-CD3/CD28 pärlor. Dessa resultat tyder på att närtumör-specifika T-celler testas med icke-tumör-specifika T-celler, kan Fas-ligand blockad behövas för att reducera icke-TCR-medierade interaktioner till ett minimum. Alternativt, när man använder kortsiktiga odlade T-cellinjer i vilka endast en bråkdel av de T-celler är specifik för antigenet som används för ex vivo-generering skulle möjligheten av MHC mismatch-förmedlad T-cellaktivering uppträda vilket kan leda till icke-specifik lys. I detta fall kan tillsatsen av antikroppar som blockerar irrelevanta Hlas vara befogat. För att bestämma om de p369-specifika T-celler att döda tumörceller i en HLA klass I-beroende sätt, antingen anti-HLA-klass I-antikropp eller isotypkontroll-antikropp sattes till samkulturer. Såsom visas i fig. 3C, lys genom p369-specifika T-celler undertrycktes genom inkludering av antikropp visar HLA klass I-restriktionsställe. Slutligen, eftersom utvecklingen av denna analys till stor del göras med SKBR3, var det viktigt att förvissa sig om andra vidhäftande HLA-A2 och HER-2/neu uttryckande tumörceller kunde dödas genom p369-specifika T-celler. Således var T-celler framställdes och tillsattes i en 01:05-förhållande till den HLA-A2 och HER-2/neu-expressing tumörceller, SKBR3, MCF-7, och HCC1419 celler. Den HLA-A2-negativa tumörcellinje var BT20 användes som en negativ kontroll. Såsom visas i fig. 3D, alla dessa ytterligare tumörceller, utom BT20 dödades också som bedömt av impedans. Således verkar metoden att vara användbara för flera mål vidhäftande tumörceller. Impedansen-baserad analys är känsligare än standard kromfrisättningsanalys vid detektering cytotoxisk T-cellsaktivitet Den krom (51 Cr) frisättningsanalys (CRA) som mäter cytolytisk aktivitet har länge varit den gyllene standard som att övervaka CD8 T cells svar. I denna analys är målceller (t.ex. tumörceller) märkt med 51 Cr. I de flesta fall, kan friska målceller behålla majoriteten avradiomärka under loppet av analysen. CD8 T-celler tillsätts till målcellerna, vanligtvis vid varierande koncentrationer, och dödande av målcellerna detekteras genom frisättning av 51 Cr till mediet. Bortsett från det faktum att den använder farlig strålning, två stora problem med CRA är en brist på känslighet och att analysen normalt kräver stora mängder av CD8 T-celler, vilket begränsar dess användbarhet. För att avgöra om impedansen-baserad analys var känsligare än CRA, HER-2/neu p369-specifika T-celler genererades in vitro och tillämpad i varierande mängder, till antingen E-plattor innehållande omärkta tumörceller eller vanliga plattor polypropylen innehållande 51 Cr-märkta målceller. Mätningar, antingen impedans eller fri krom, mättes vid 5 timmar efter T-cell tillägg. Figur 4, ett representativt exempel, visar impedansen analysen utklassar kromfrisättning. Den intra-assay variationav impedansen-baserad analys är typiskt under 20%. Intra-assay variation undersöktes, eftersom ökad användning av denna analys kommer till stor del bestäms av dess reproducerbart och variation (Figur 5). Två p369-specifika T-cellstammar togs fram oberoende av varandra 30 dagars mellanrum och tillsattes i triplikat över ett område av tumörcell till T-cell-nyckeltal. Den infällda diagrammet i figur 5 visar att linjerna var i stort sett likvärdiga i fråga om lys SKBR3 celler. Den% variationskoefficient beräknades vid varje cell ratio och ritas. Såsom visas i figur 5, från 1:40 till 01:05 förhållanden för% variationskoefficienterna (CV) var lägre än 15%. Vid 1:2,5 och 1:1,25, dock var CV hög eller oförutsägbar. På grund av omfattande biologic variation, är det inte möjligt att mäta inter-assay variabilitet med primära T-cellinjer. <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Impedans måste normaliseras efter tillsatsen av T-cellerna. Panel A: visar att tumörceller (röd linje) och inte T-celler (blå linje) är ansvariga för impedans. Här visas de impedans kurvor över 40 timmar för antingen tumör eller T-celler ensamma. Liknande resultat erhölls från ett andra experiment. Observera att signalen perturbation vid ca 20 timmar representerar punkten för tillsats av T-celler till brunnarna som inte innehåller tumörceller Panel B:. Visar att impedansmätningar transient störs med tillsats av T-celler till tumörceller. Detta kräver normalisering vid någon tidpunkt efter tillägg av T-celler (se punkt normalisering markerade i diagrammet). Spår består av duplicerade datapunkter. Spåret för tumörceller enbart visas i rött. De andra spår representerar tumörceller co-odlade med HER-2/neu p369-specifika T-celler (Blå: ratio på 1,25 T-celler / tumör cell, Grön:förhållande av 40 T-celler / tumör cell). Varje spår beräknas från duplicerade datapunkter som samlats var 5 minuter genom varaktigheten av kulturen. Resultaten är representativa för 3 separata experiment. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Minskning av impedans som medieras av T-celler är dosberoende. Panel A: Visat är de impedans spår av SKBR3 tumörceller inkuberades ensam eller med varierande koncentrationer av tumörspecifika T-celler. Varje spår beräknas utifrån triplikata datapunkter samlas in var 5 minuter genom varaktigheten av kulturen. Resultaten är representativa för 3 separata experiment Panel B:. Visas är cellen index på 10 timmar över hela T-cell / tumör cellkoncentrationer. Den streckade linjen representerar cellen Indexet för tumörceller alett. Varje symbol är medelvärdet (± SEM) av trefaldiga bestämningar. Resultaten är representativa för 3 separata experiment. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Impedansen baserad analys detekterar antigen-specifika cytotoxiska T-cellsvar. Panel A visar graden av lys av SKBR3 celler genom HER-2/neu p369-specifika T-celler (röd) eller influensa-specifika T-celler (blått) vid 5, 10 och 15 timmar efter co-kultur. Varje datapunkt är medelvärdet (± SEM) av trefaldiga mätningar. Resultaten är representativa för tre separata experiment. Panel B visar lys av SKBR3 genom p369-specifika T-celler eller icke-specifikt aktiverade T-celler, vilket visar att antigen-specifik lys inte beror på Fas-Fas-ligand interaktioner. Svarta staplar representerar co-kulturer sominnehöll en antikropp Fas-ligand. Varje stapel är medelvärdet (± SEM) lys i triplikat vid 5 timmar efter tillsatsen av T-celler. Resultaten är representativa för tre separata experiment. Fält C visar lys 10 timmar efter T-cell tillsats av SKBR3 genom p369-specifika T-celler är HLA-klass I-beroende. Antingen HLA-klass I-blockerande eller isotypkontroll sattes under samodling. Varje stapel är medelvärdet (± SEM) lys i tre exemplar. Detta experiment upprepades två gånger med liknande resultat. Visar% lys 10 timmar efter T-cell tillägg av flera HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing tumörcellinjer från p369-specifika T-celler Panel D. BT20 genomfördes en HLA-A2-negativa bröstcancer cellinje som användes som en negativ kontroll. Varje plats utgör ett unikt experiment beräknas triplikatbestämningar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3683/3683fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg&quot; alt = &quot;Bild 4&quot; /&gt; Figur 4. Impedansen baserad analys är känsligare än kromfrisättningsanalys för påvisande av tumör antigen-specifika T-celler. Är% lys av SKBR3 som svar på varierande koncentrationer av p369-specifika T-celler, mätt vid 5 timmar efter tumör-och T-cell Visas blandning med användning av både den impedans-baserad analys och kromfrisättningsanalys. Varje symbol är medelvärdet (± SEM) av tre replikat. Resultaten är representativa för tre separata experiment. <img src="/files/ftp_upload/3683/3683fig5.jpg" alt="Figur 5"/> Figur 5. % Intra-assay variationskoefficienterna av impedans-baserade T-cell cytotoxicitet. Visade är medelvärden (± SD)% intra-assay variationskoefficienter i lys av SKBR3 över ett intervall av koncentrationer av antigen-specifika T-celler. Varje symbol är medelvärdet av tre replikat. Siffrorna i diagrammet är than menar% CV. Inset panelen visar medelvärdet (± SEM, n = 3)% lys av SKBR3, vid varierande koncentrationer av p369-377-specifika T-celler. Två oberoende genererade p369-specifika T-cellinjer med T-celler från två olika givare visas.

<ol>
	<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cells:+foot+soldiers+of+the+immune+system.">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35, 161-168 (2011).</li><li>Garboczi, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+complex+between+human+T-cell+receptor,+viral+peptide+and+HLA-A2.">Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2.</a> Nature. 384, 134-141 (1996).</li><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).</li><li>Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+assay+focusing+on+perforin+release+mechanisms+of+cytotoxic+T+lymphocytes.">A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes.</a> J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).</li><li>Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+CD107a+expression+and+cytotoxic+activity.">Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity.</a> Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).</li><li>Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+a+HER-2/neu+helper+peptide+vaccine+generates+HER-+2/neu+CD8+T-cell+immunity+in+cancer+patients.">Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients.</a> J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).</li><li>Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta/TNF(alpha)-mediated+epithelial-mesenchymal+transition+generates+breast+cancer+stem+cells+with+a+claudin-low+phenotype.">TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype.</a> Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).</li><li>Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+assays.+Experimental+design+and+statistical+analysis.">Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis.</a> J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).</li><li>Gallimore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+exhaustion+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+visualized+using+soluble+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complexes.">Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes.</a> J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).</li></ol>

Produktion och fri tillgång till denna video-artikeln är sponsrad av Roche Diagnostics.

CD8 T-celler är viktiga för det adaptiva immunsvaret, att kunna direkt döda infekterade eller maligna celler 4. Medan det finns flera sätt att mäta antalet antigen-specifika CD8 T-celler (t.ex. ELISpot, tetramer, flödescytometri), ofta är det bra att veta om dessa celler är funktionellt cytotoxiska 3. Den mest kända analysen för att bedöma cytotoxiska funktionen är CRA, som anses vara den gyllene standarden analys 4. Stora begränsningar i CRA är (1) kravet på radioaktivitet, (2) brist på känslighet, (3) brist på information om verkningsmekanismer, (4) krav på stora mängder celler, och (5) mödosam upplägg. Således, under det senaste decenniet har det funnits intresse av att anta nya strategier för att minimera dessa begränsningar. Nyare metoder inkluderar de som mäter caspase frisättning 4, BLT esterase activity5 och yta uttryck av CD107 6. Föreliggande manuskript antyder attimpedansen-baserad analys, utförs på Roche xCELLigence systemet, kan också vara användbara som ett alternativ till CRA. Förmågan att anpassa impedansen synsätt vilar på observationen att T-celler, som inte är fastbrända tätt till ytor, inte verkar ha någon större inverkan på impedansen vilket minskar någon oro för direkt inblandning av T-cellerna med mätningen. Det arbete som krävs för användandet av impedansen testsystemet förväntas bli betydligt lägre främst på grund av avskaffandet av de regulatoriska farhågor för användning av radioaktivitet. Den enda märkbara nackdelen av impedansen-baserat system är att ett utlägg av $ 50.000 till $ 60.000 krävs för inköp av xCELLigence enheten. Emellertid eliminerar xCELLigence enheten behovet av en strålning räknare och är betydligt mer mångsidig, är användbara för att bedöma cellulära svaret på narkotika och migration utöver T-cell cytotoxicitet 8. De observationer somminskningen i tumörcellen impedans är dosberoende, föreslår som avbildas i figur 2, med en någorlunda brant lutning följa en enkel sekundär kvadratisk funktion att analysen skulle kunna användas i begränsande utspädningsprocedurer analyser (LRAerna) för att uppskatta frekvensen av cytotoxiska celler 9 . En fördel med impedansen synsätt är att antalet T-celler och krävs tumörceller är mindre än CRA, vilket gör LDA potentiellt mer genomförbart. Till exempel i CRA, vid ett 01:40-förhållande, ett x 10 5 tumörceller per brunn är pläterade som kräver 4 x 10 6 totala T-celler per brunn. Men i impedans-baserad analys är det endast 1,5 x 10 4 tumörceller per brunn behövs, som förbrukar endast 6 x 10 5 totala T-celler per brunn. Således använder impedansen-baserad analys 85% mindre T-celler och tumörceller. Denna reduktion antyder att impedansen-baserade systemet kunde anpassas till immunologisk övervakning i humana kliniska prövningar där than volymer av blod drar kan vara begränsad. Också, medan CRA är begränsad till en enda tidpunkt, samlar impedansen-baserad analys kontinuerliga realtidsdata, så att användaren kan jämföra flera punkter lys tid på samma experiment med minimal extra arbetskraft och celler. Frekvens beräkningar skulle potentiellt kunna kombineras med andra strategier som inte mäter funktion såsom tetramer analyser för att fastställa förhållandet mellan funktionella cytotoxiska T-celler till totala antigen-specifika CD8 T-celler 10. En av de mest tilltalande funktioner i impedansen synsätt är att, till skillnad från de flesta andra analyser kan cytotoxicitet övervakas i realtid, eventuellt gör det lättare att studera cellulära interaktioner med användning av hämmare eller antikroppar. En annan är att metoden kan vara lämpliga för tumörceller som motstår märkning. Slutligen, eftersom de icke-dödade tumörceller inte är märkta och förblir sterila, ytterligare skörd och studiet av T-cell-resistenta celler är possible. Sammanfattningsvis, medan båda systemen ger tumör dödande data som svar på specifika T-celler, är impedansen-baserad analys känsligare än CRA och ger en mer flexibel plattform.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Paque Plus </td>
 <td>GE Healthcare </td>
 <td>17-1440-03 </td>
 <td>Used to isolate PBMCs from blood </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 </td>
 <td>Cellgro </td>
 <td>10-040-CV </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS </td>
 <td>Denville Scientific </td>
 <td>FB5001-H </td>
 <td>Cell culture media </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human IL-2 </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>14-8029-81 </td>
 <td>For stimulating growth of T cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Interferon gamma </td>
 <td>Cell Sciences </td>
 <td>CR2026 </td>
 <td>For stimulating MHC expression in tumor cells </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HER-2/neu p369-377 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence KIFGSLAFL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Influenza p58-66 peptide </td>
 <td>Mayo Clinic peptide synthesis core </td>
 <td>amino acid sequence GILGFVFTL </td>
 <td>Binds to HLA-A2 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>111-61D </td>
 <td>For non-specific T cell activation and expansion </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chromium-51 </td>
 <td>MP Biomedicals </td>
 <td>62015 </td>
 <td>CRA labeling reagent </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-plate </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>05469830001 </td>
 <td>For xCelligence impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luma plate 96 </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>6005630 </td>
 <td>For measuring radioactivity in the Top Count NXT. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>xCelligence RTCA DP Station </td>
 <td>Roche Applied Science </td>
 <td>RTCA DP </td>
 <td>Impedance unit </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top Count NXT </td>
 <td>Perkin Elmer </td>
 <td>C990601 </td>
 <td>Scintillation &amp; Luminescence Counter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fas Ligand antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>556372</td>
 <td>For blocking Fas-Fas ligand interactions</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>551230</td>
 <td>For blocking HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse IgG2b, &kappa;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555740</td>
 <td>Isotype control for HLA class I</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SKBR3 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-30</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MCF7 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-22</td>
 <td>Adenocarcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCC1419 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>CRL-2326</td>
 <td>Primary ductal carcinoma</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT20 tumor line</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td>Carcinoma</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

determining optimal cytotoxic activity of human her2neu specific cd8 t cells by comparing the cr51 release assay to the xcelligence system

Cytotoxiska CD8 T-celler utgör en undergrupp av T-celler som har förmåga att inducera död av infekterade eller maligna värdceller 1. Dessa celler uttrycker en specialiserad receptor, som kallas T-cellreceptorn (TCR), som kan känna igen en specifik antigen peptid bunden till HLA-klass I-molekyler 2. Ingrepp av infekterade celler eller tumörceller genom deras HLA klass I-molekyl resulterar i produktion av lytiska molekyler såsom granzymes och Perforin resulterar i mål-celldöd. Även om det är lämpligt att bestämma frekvenser av antigenspecifika CD8 T-celler med användning av analyser såsom ELISPOT eller flödescytometri, är det också användbart för att fastställa styrkan av CD8 T-cellssvar som använder cytotoxicitetsanalyser 3. Den mest kända analysen för att bedöma cytotoxiska funktion är kromfrisättningsanalys (CRA), vilket anses vara en standardanalys 4. Den CRA har flera begränsningar, inklusive exponering av cellerna för gammastrålning, lack av reproducerbarhet, och ett krav för ett stort antal celler. Under det senaste årtiondet har det funnits intresse av att anta nya strategier för att övervinna dessa begränsningar. Nyare metoder inkluderar de som mäter caspase frisättning 4, BLT esterasaktivitet 5 och yta uttryck av CD107 6. Impedansen-baserad analys, med hjälp av Roche xCELLigence systemet, undersöktes i detta papper för dess potential som ett alternativ till CRA. Impedans eller motstånd mot en elektrisk ström uppstår när vidhäftande tumörceller binder till elektrodplattor. Tumörceller loss efter avlivning och elektrisk impedans minskar vilket kan mätas genom xCELLigence systemet. Förmågan att anpassa impedansen-baserad metod för att bedöma cell-medierad dödandet vilar på observationen att T-celler inte hålla tätt på de flesta ytor och tycks inte ha någon större inverkan på impedansen vilket minskar någon oro för direkt inblandning av T-cellerna medmätningen. Resultaten visar att impedansen-baserad analys kan upptäcka förändringar i nivåerna av antigen-specifika cytotoxiska CD8 T-celler med ökad känslighet i förhållande till standarden CRA. Baserat på dessa resultat, kan impedans-baserade metoder vara goda alternativ till kreditvärderingsinstitut eller andra metoder som syftar till att mäta cytotoxiska CD8 T-cell-funktionalitet.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System at JoVE.com

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Den kromfrisättningsanalys, en gemensam analys för att detektera cytotoxisk T-cellaktivitet, har flera begränsningar. Använda antigen-specifika CD8 T-celler och human bröstcancer tumörlinje, SKBR3, i denna artikel, har en impedans ansats undersöktes för förmågan att detektera celldöd.

Att avgöra den optimala cytotoxiska aktiviteten hos mänskliga Her2neu specifika CD8 T-celler genom att jämföra Cr51 frisättningsanalysen till xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Metoder för att bedöma Beta Medierad Celldöd genom Cytotoxiska T-lymfocyter

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Fastställande av fagocyterande förmåga för klinisk Antibody prover

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In vitro-analys för att utvärdera effekten av immunPathWays på HIV-specifika CD4 T-cell effektorfunktion

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatiserad cell Anrikning av cytomegalovirus-specifika T-celler för kliniska tillämpningar med hjälp av cytokin-infångningssystemet

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analys av Simian Immunodeficiency Virus-specifika CD8<sup&gt; +</sup&gt; T-celler i rhesusmakaker av peptid-MHC-I tetramer färgning

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer färgning och kvantitativ analys att bestämma plats, överflöd och fenotyp av Antigen-specifika CD8 T-celler i vävnader

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...