Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af NIH give R01 AI073783 til K. Teter. Vi takker Dr. Shane Massey for bistand til udvikling af subcellulære fraktionering protokollen og Helen Burress til kritisk læsning af manuskriptet.

1. Udarbejdelse af digitonin <ol><li> Tilsæt 500 μL af 100% ethanol til et mikrocentrifugerør og læg den i en varmeblok indstillet til 80 ° C i 10 min. </li><li> Opløs 2,5 mg digitonin i 250 μL af den opvarmede ethanol til at producere en 1% stamopløsning af digitonin. </li><li> For at generere en arbejdsgruppe løsning på 0,04% digitonin, der tilsættes 40 μL af digitonin stamopløsning til 960 μL af HCN buffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, og en protease...

Sammenligning med eksisterende metode Vores SPR-baserede translokation analyse repræsenterer en hurtig, følsom, og kvantitativ metode til at påvise toksinet levering i værten cytosol. Teknikken kræver ikke radioaktiv mærkning eller andre ændringer af toksin, og det kan anvendes på alle giftstof, som en anti-toksin A kæde antistof er til rådighed. Eksisterende metoder til at overvåge toksin passage ind i cytosol er også afhængige af en subcellulære fraktioner protokol til partitio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> ACROS </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Føtalt bovint serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliosid GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Liste </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Pierce </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamin </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA antistof </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC-80747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB antistof </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 antistof </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC-57639 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor dias </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Sprøjtepumpe </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB toksiner består af en enzymatisk A subunit og en celle-bindende B subunit 1. Disse giftstoffer udskilles i det ekstracellulære miljø, men de handler på mål inden for eukaryote cytosolen. Nogle AB toksiner rejse med Blære luftfartsselskaber fra cellens overflade til det endoplasmatiske reticulum (ER), inden de kommer ind i cytosolen 2-4. I ER, at den katalytiske En kæde dissocieres fra resten af toksinet og bevæger sig igennem en protein-ledende kanal nå sit cytosolisk mål 5. De omplantes, cytosole En kæde er svær at opdage, fordi toksin menneskehandel til skadestuen er en yderst ineffektiv proces: De fleste internaliserede toksin er dirigeres til lysosomerne for nedbrydning, så kun en lille brøkdel af overflade-bundet toksin når Golgi apparatet og ER 6 -12. At overvåge toksin translokation fra ER til cytosolen i dyrkede celler, vi kombinerede en subcellulære fraktioner protokol med highly følsom påvisningsmetode af overflade plasmon resonans (SPR) 13-15. Plasma membran af toksin-behandlede celler er selektivt permeabilized med digitonin, så samling af et cytosol fraktion, som efterfølgende perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-toksin A kæde antistof. Den antistof-belagt sensor kan fange og afsløre pg / mL mængder af cytosolisk toksin. Med denne protokol, er det muligt at følge kinetikken af ​​toksin indtræden i cytosolen og at beskrive hæmmende på translokation begivenhed. Koncentrationen af ​​cytosole toksin kan også beregnes ud fra en standardkurve genereret med kendte mængder af en kæde standarder, der er blevet perfunderet over sensoren. Vores metode er en hurtig, følsom, og kvantitative detektion system, der ikke kræver radioaktiv mærkning eller andre ændringer til målet toksin.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

I denne rapport beskriver vi, hvordan overfladen plasmon resonans bruges til at påvise toksinet indrejse i værten cytosol. Denne meget følsom metode kan give kvantitative data om mængden af ​​cytosole toksin, og det kan anvendes til en række af toksiner.

Påvisning af toksin translokation i værtslandet cytosolen af ​​overflade plasmon resonans

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Påvisning af Invasiv pulmonal aspergillose hos maligne hæmatologiske lidelser patienter ved hjælp af lateral strømning og Teknologi

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse af<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokation i værtsceller Brug Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

påvisning af<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant overfladeglycoprotein Skift af magnetisk cellesortering og flowcytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokoller til Undersøgelse af Host-væv Distribution, Transmission-tilstand, og Effekt på Host Fitness af en densovirus i bomuldsfrøkapselorm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning af Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisering i Murine vært ved Non-invasiv In Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Tidsmæssig analyse af nukleare til cytoplasmatisk omplantning af en Herpes Simplex Virus 1 Protein af immunfluorescent konfokalmikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Påvisning af toksin translokation i værtslandet cytosolen af ​​overflade plasmon resonans

Påvisning af toksin translokation i værtslandet cytosolen af overflade plasmon resonans