Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom NIH R01 AI073783 K. Teter finanziert. Wir danken Dr. Shane Massey um Hilfe bei der Entwicklung der subzellulären Fraktionierung-Protokoll und Helen Burress für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Vorbereitung der Digitonin <ol><li> Add 500 mL 100% Ethanol zu einem Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in einem Heizblock bei 80 ° C für 10 min eingestellt. </li><li> Lösen von 2,5 mg Digitonin in 250 ul der beheizten Ethanol bis zu einer 1% Stammlösung von Digitonin zu produzieren. </li><li> So generieren Sie eine funktionierende Lösung von 0,04% Digitonin, dann werden 40 ul der Digitonin-Stammlösung zu 960 ul der HCN-Puffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-Ethylmal...

Vergleich zu bestehenden Methoden Unsere SPR-basierter Assay Translokation stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Methode zur Toxin Lieferung in die Host-Cytosol zu erkennen. Die Technik erfordert keine radioaktiven Markierung oder sonstige Änderungen, um das Toxin, und es kann auf jeden Toxin, für die eine anti-Toxin A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Bestehende Methoden zur Toxin Passage in das Zytosol Monitor beruhen auch auf eine subzelluläre Fraktionierung Pro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliosid GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Liste </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimid) </td><td> Durchstechen </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA-Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB Antikörper </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR-Sensor Dias </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB Toxine bestehen aus einer enzymatischen A-Untereinheit und einer Zell-bindenden B-Untereinheit 1. Diese Toxine sind in das extrazelluläre Milieu ausgeschieden, aber sie wirken auf Ziele innerhalb der eukaryotischen Cytosol. Einige AB Toxine Reise durch Vesikel Träger von der Zelloberfläche zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) vor dem Eintritt in das Zytosol 2-4. In der Notaufnahme, um die katalytische A-Kette distanziert sich von dem Rest des Toxins und bewegt sich durch ein Protein-leitenden Kanals erreichen ihren zytosolischen Ziel 5. Die transloziert, cytosolische Eine Kette ist nur schwer zu erkennen, weil Toxin Menschenhandel, die ER ist ein sehr ineffizienter Prozess: Die meisten verinnerlicht Toxin wird zu den Lysosomen zum Abbau geführt, so dass nur ein kleiner Bruchteil der Oberflächen-gebundenen Toxin gelangt der Golgi-Apparat und ER 6 -12. Zur Überwachung Toxin Translokation aus dem ER ins Zytosol in kultivierten Zellen, kombinierten wir eine subzelluläre Fraktionierung-Protokoll mit den highly empfindliche Nachweismethode der Surface Plasmon Resonance (SPR) 13-15. Die Plasmamembran der Toxin-behandelten Zellen selektiv mit Digitonin permeabilisiert, wodurch Sammlung eines zytosolischen Fraktion, die anschließend über einen SPR-Sensor mit einer Anti-Toxin A-Antikörper beschichtet ist, perfundiert. Die Antikörper-beschichteten Sensor kann erfassen und erkennen pg / mL Mengen von zytosolischen Toxin. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kinetik der Toxin-Eintrag in das Zytosol zu folgen und hemmende Wirkung auf die Translokation Ereignis zu charakterisieren. Die Konzentration der zytosolischen Toxin kann auch aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen von A-Kette Standards, die über den Sensor wurden perfundiert, festgesetzt werden. Unsere Methode stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Nachweis-System, das keine radioaktiven Markierung oder andere Änderungen an der Ziel-Toxin.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

In diesem Bericht beschreiben wir, wie Oberflächen-Plasmon-Resonanz verwendet wird, um Toxin Einreise in den Aufnahmemitgliedstaat Zytosol zu erkennen. Dieser hochempfindliche Methode lassen sich quantitative Daten über die Höhe der zytosolischen Toxin geben, und es kann zu einer Reihe von Toxinen eingesetzt werden.

Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Nachweis von<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Zeitliche Analyse der nuklearen-cytoplasmatische Translokation eines Herpes-Simplex-Virus 1-Proteins Immunofluorescent konfokalen Mikroskopie

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...