Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R01 AI073783 כדי Teter ק. אנו מודים לד&quot;ר שיין מאסי לסיוע בפיתוח של חלוקה פרוטוקול subcellular והלן Burress לקריאה ביקורתית של כתב היד.

1. הכנת digitonin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של אתנול 100% צינור microcentrifuge ולמקם אותו בתוך גוש חום נקבע על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.5 מ&quot;ג digitonin ב 250 μL של אתנול המחומם לייצר פתרון המניה 1% digitonin. </li><li style=";text-al...

השוואה המתודולוגיה הקיימת Assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה מייצג שיטה מהירה, רגיש, כמותי כדי לזהות משלוח רעלן לתוך cytosol המארח. הטכניקה אינה דורשת radiolabeling או שינויים אחרים הרעלן, וזה יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי רעלן נוגדנים ש?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> סיגמא </td><td> D141 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> סיגמא </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> סיגמא </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> רשימה </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> לנקב </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> סיGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC-80747 </td></tr><tr><td> נוגדן Anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 נוגדן </td><td> סנטה קרוז ביוטק </td><td> SC-57639 </td></tr><tr><td> Refractometer </td><td> רייכרט </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR חיישן שקופיות </td><td> רייכרט </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> מזרק משאבה </td><td> קול פאלמר </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

רעלים AB מורכב האנזימטית למקטע ו למקטע תא מחייב B 1. רעלנים אלה מופרשים אל הסביבה תאיים, אבל הם פועלים על מטרות בתוך cytosol האיקריוטים. יש רעלים א.ב. לנסוע נושאות שלפוחית ​​מפני השטח של התא אל reticulum endoplasmic (ER) לפני הכניסה cytosol 2-4. ב ER, קטליטי שרשרת מנתק משאר הרעלן ועובר דרך ערוץ חלבון מנהלת להגיע ליעד cytosolic שלה 5. Translocated, cytosolic שרשרת קשה לזהות כי סחר רעלן לחדר המיון הוא תהליך יעיל ביותר: רעלן הפנימו ביותר מנותבת אל lysosomes של השפלה, ולכן רק חלק קטן של רעלן פני הנכנס מגיע מנגנון Golgi ו - ER 6 -12. כדי לפקח על טרנסלוקציה רעלן מ ER כדי cytosol של תאים בתרבית, ששילבנו פרוטוקול חלוקה subcellular עם highly שיטה לגילוי רגיש של plasmon משטח תהודה (SPR) 13-15. קרום הפלזמה של תאים שטופלו הוא רעלן permeabilized סלקטיבי עם digitonin, המאפשר איסוף של שבריר cytosolic אשר perfused לאחר מכן על החיישן SPR מצופה רעלן אנטי נוגדנים שרשרת. החיישן נוגדן מצופה יכולים ללכוד לזהות pg / mL כמויות של רעלן cytosolic. באמצעות פרוטוקול זה, אפשר לעקוב אחר קינטיקה של כניסה רעלן לתוך cytosol ו לאפיין תופעות מעכבות על האירוע טרנסלוקציה. ריכוז של טוקסין cytosolic ניתן גם לחשב עקומת סטנדרט שנוצר עם כמויות ידוע של סטנדרטים בשרשרת כי כבר perfused על החיישן. השיטה שלנו מייצג מערכת מהירה, זיהוי רגיש, כמותי שאינו מחייב radiolabeling או שינויים אחרים רעלן היעד.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

בדו&quot;ח זה, אנו מתארים כיצד plasmon משטח תהודה משמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך cytosol המארח. שיטה זו רגישה מאוד יכול לספק נתונים כמותיים על כמות הרעלן cytosolic, וזה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלים.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

איתור של<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; מיתוג גליקופרוטאין Surface Variant ידי מגנטי Activated Cell מיון cytometry זרימה

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...