Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
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이 작품은 K. Teter에 NIH R01 부여 AI073783에 의해 투자되었다. 우리는 원고의 중요한 읽기위한 subcellular 분별화 프로토콜과 헬렌 Burress의 개발에 도움 박사 쉐인 메시 감사합니다.

1. digitonin의 준비 <ol><li> microcentrifuge 튜브에 100 % 에탄올 500 μL를 추가하고 80 ° C 10 분에 대해 설정된 열 블록에 넣습니다. </li><li> digitonin의 1 % 주식 솔루션을 생산하는 온수 에탄올 250 μL에 dig​​itonin 2.5 MG를 해산. </li><li> 0.04 %의 digitonin의 작업 솔루션을 생성하려면, HCN 버퍼 960 μL (50 MM의 Hepes 산도 7.5, 150 MM NaCl, 2 MM CaCl 2, 10 MM N - ethylmaleimide, 그리고 테아제 억제제에 digitonin 주식 솔루션 ...

기존의 방법론 비교 우리 SPR 기반 translocation 분석은 호스트 cytosol에 독소 전송을 감지하는 빠른, 민감한, 그리고 양적 방법을 나타냅니다. 기술 radiolabeling이나 독소에 다른 수정을 요구하지 않으며, 그것은 체인 항체를 사용할 수있는 해독제에 대한 독소를 적용할 수 있습니다. cytosol에 독소 통로를 모니터링하는 기존 방법은 별도의 cytosol과 막 분수 11, 23, 27, 28으로 파?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> 시그마 </td><td> D141 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> 시그마 </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> 시그마 </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> 목록 </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N - Hydroxysuccinimide) </td><td> 찌르다 </td><td> 24,500 </td></tr><tr><td> EDC (1 - 에​​틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide) </td><td> 써모 과학 </td><td> 22,981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> 시GMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> 안티 CTA 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 80747 </td></tr><tr><td> 안티 CTB 항체 </td><td> Calbiochem </td><td> 227,040 </td></tr><tr><td> 안티 PTS1 항체 </td><td> 산타 크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 57639 </td></tr><tr><td> 굴절계 </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR 센서는 슬라이드 </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 콜 팔머 </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB의 독소 subunit 효소와 세포 결합의 B subunit 1로 구성되어 있습니다. 이러한 독소는 세포 환경으로 분비하지만, 그들은 진핵세포 cytosol 내의 대상에 따라 행동하고 있습니다. 세포 표면에서 cytosol 2-4 들어가기 전에 endoplasmic reticulum (ER)에 소포 항공사에 의해 일부 AB 독소 여행. 응급실에서 독소와 이동의 나머지 부분에서 단백질 실시 채널을 통해 촉매 체인 dissociates은 cytosolic 목표 5에 도달합니다. 응급실에 독소 거래가 매우 비효율적 프로세스이기 때문에 translocated, cytosolic 체인은 감지하기가 어렵습니다 : 대부분의 내면 독소는 잠돌군 Zz 장치 및 ER 6에 도달 표면 바운드 독소의 작은 파편 때문에 전용 저하에 대한 lysosomes로 라우팅됩니다 -12. 응급실에서 교양 세포의 cytosol에 독소의 translocation을 모니터하기 위해, 우리는 highl과 subcellular 분획화 프로토콜을 결합표면 plasmon 공명 (SPR) 13-15의 Y 민감한 검출 방법. 독소 - 치료 세포의 플라즈마 막은 선택 후 해독제 체인 항체와 코팅 SPR 센서를 통해 perfused하는 cytosolic 분수의 컬렉션을 수 있도록 digitonin와 permeabilized 있습니다. 항체 - 코팅 센서 cytosolic 독소의 PG / ML 수량을 캡처하여 검색할 수 있습니다. 이 프로토콜로, 그것은 cytosol에 독소 항목의 속도론를 수행하고 translocation 이벤트에 대한 억제 효과를 특성화 수 있습니다. cytosolic 독소의 농도는 또한 센서를 통해 perfused되었습니다 체인 표준의 알려진 수량과 생성된 표준 곡선으로부터 계산하실 수 있습니다. 우리의 방법은 radiolabeling 또는 대상 독소 다른 수정을 요구하지 않는 빠른, 민감한, 그리고 양적 탐지 시스템을 나타냅니다.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

이 보고서에서는, 우리는 표면 plasmon 공명이 호스트 cytosol에 독소 항목을 검색하는 데 사용됩니다 방법에 대해 설명합니다. 이것은 매우 민감한 방법은 cytosolic 독소의 양에 양적 데이터를 제공할 수 있으며,이 독소의 범위에 적용할 수 있습니다.

표면 Plasmon 공명하여 호스트 Cytosol에 독소를 Translocation의 감지

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

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분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

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적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

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검출<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em자기 활성 셀 정렬 및 유동 세포 계측법에 의해&gt; 변형 표면 당 단백질 전환

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

코튼 면화씨 벌레의 Densovirus의 호스트 피트니스에 호스트 조직 배포, 전송 모드 및 효과 조사를위한 프로토콜

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

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생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

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살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

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Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...