Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R01 AI073783 til K. Teter. Vi takker Dr. Shane Massey for bistand i utviklingen av subcellular fraksjonering protokollen og Helen Burress for kritisk lesing av manuskriptet.

1. Utarbeidelse av digitonin <ol><li> Legg til 500 mL av 100% etanol til en mikrosentrifuge tube og legg den i en varme blokk innstilt på 80 ° C i 10 min. </li><li> Løs 2,5 mg digitonin i 250 mL av det oppvarmede etanol å produsere en 1% stamløsning av digitonin. </li><li> For å generere en fungerende løsning på 0,04% digitonin, tilsett 40 mL av digitonin stamløsning til 960 mL av HCN buffer (50 mM Hepes 7,5 pH, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, og en proteasehemmer cocktail). </li>...

Sammenligning med eksisterende metodikk Våre SPR-baserte translokasjon analysen representerer en rask, følsom, og kvantitative metode for å detektere toxin levering i verten cytosol. Teknikken krever ikke radiolabeling eller andre endringer av giftstoffer, og det kan brukes på alle toksin som en anti-toksin A kjede antistoff er tilgjengelig. Eksisterende metoder for å overvåke toxin passasje inn i cytosol også stole på en subcellular fraksjonering protokoll for å partisjonere celle ek...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> List </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Pierce </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Ethanolamine </td><td> SiGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA antistoff </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB antistoff </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 antistoff </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor lysbilder </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Sprøytepumpe </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB giftstoffer består av en enzymatisk A subenhet og en celle-bindende B-subenhet 1. Disse giftstoffer skilles ut i ekstracellulære miljøet, men de handle på mål i eukaryote cytosol. Noen AB giftstoffer reise med vesicle bærere fra cellen overflate til det endoplasmatiske retikulum (ER) før vi går i cytosol 2-4. I ER, til katalytiske En kjede spaltes fra resten av toksinet og beveger seg gjennom et protein-ledende kanal nå sitt cytosoliske mål 5. Den translocated, cytosoliske En kjede er vanskelig å oppdage fordi toksinet trafficking til ER er en svært ineffektiv prosess: De fleste internalisert toksinet er rutet til lysosomer for degradering, så bare en liten brøkdel av overflate-bundet toksinet når Golgi-apparatet og ER 6 -12. For å overvåke toksin translokasjon fra ER til cytosol i dyrkede celler, kombinerte vi en subcellular fraksjonering protokoll med highly sensitive deteksjonsmetode av overflaten plasmon resonans (SPR) 13-15. Plasma membran av toksin-behandlede cellene er selektivt permeabilized med digitonin, slik samling av en cytosoliske brøkdel som deretter perfused over en SPR sensor belagt med en anti-toksin En kjede antistoff. Antistoff-belagte sensor kan fange opp og oppdage pg / ml mengder cytosoliske toksin. Med denne protokollen, er det mulig å følge kinetikken av toksin oppføring i cytosol og å karakterisere hemmende effekter på translokasjon hendelsen. Konsentrasjonen av cytosoliske toksinet kan også beregnes fra en standard kurve generert med kjente mengder av en kjede standarder som har blitt perfused over sensoren. Vår metode representerer en rask, følsom, og kvantitative deteksjon system som ikke krever radiolabeling eller andre modifikasjoner til målet toxin.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

I denne rapporten beskriver vi hvordan overflaten plasmon resonans blir brukt til å påvise toksin innreise til verten cytosol. Denne svært følsom metode kan gi kvantitative data om mengden av cytosoliske toksin, og den kan brukes til en rekke giftstoffer.

Påvisning av giftstoffer translokasjon i Host cytosol ved Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Påvisning av Invasiv pulmonal aspergillose i hematologisk malignitet pasienter ved hjelp av Lateral-Strømningsteknikk

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translokasjon i vertsceller Bruke Beta-laktamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA lyddemping

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

påvisning av<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant Surface glykoprotein Bytte av Magnetic Aktivert Cell Sorting og flowcytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokoller for Gransker Host-vev distribusjon, overføring-modus, og innvirkning på vertsmaskinen Fitness av en Densovirus i Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning av enterohemorrhagiske Escherichia Coli kolonisering i Murine vert av ikke-invasiv i Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Timelige analyse av kjernefysisk-til-cytoplasmatiske translokasjon av et Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescent AC Confocal mikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...