Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01 AI073783 para K. Teter. Agradecemos ao Dr. Shane Massey para obter assistência no desenvolvimento do fracionamento subcelular de protocolo e Helen Burress para a leitura crítica do manuscrito.

1. Preparação de digitonina <ol><li> Adicionar 500 mL de etanol a 100% para um tubo de microcentrífuga e colocá-lo em um bloco de aquecimento fixado em 80 ° C por 10 min. </li><li> Dissolver 2,5 mg de digitonina em 250 mL de etanol aquecido para produzir uma solução estoque de 1% do digitonina. </li><li> Para gerar uma solução de trabalho de digitonina 0,04%, adicionar 40 mL da solução estoque para 960 mL digitonina de HCN tampão (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-etilmaleimi...

Comparação com a metodologia existente Nosso ensaio translocação SPR baseado representa um método rápido, sensível, e quantitativa para detectar entrega toxina no citosol host. A técnica não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina, e pode ser aplicado a qualquer toxina para o qual um anti-toxina Um anticorpo cadeia está disponível. Métodos existentes para monitorar a passagem de toxinas para o citosol também dependem de um protocolo de fracionamento subcel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliosídeo GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lista </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Perfurar </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Etanolamina </td><td> Sigma </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA de anticorpos </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anticorpos anti-PTS1 </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refratômetro </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor de slides </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

Toxinas AB consistem de uma subunidade enzimática A e uma célula de ligação da subunidade B 1. Estas toxinas são secretadas para o meio extracelular, mas agir de acordo com as metas dentro do citosol eucarióticas. Algumas viagens AB toxinas pelas transportadoras vesícula da superfície da célula para o retículo endoplasmático (ER) antes de entrar no citosol 2-4. Na ER, o dissocia catalítico Uma cadeia do resto da toxina e se move através de um canal condutor de proteína para atingir o seu objectivo citosólica 5. O translocados, a cadeia A citosólica é difícil de detectar porque o tráfico de toxinas para o ER é um processo extremamente ineficiente: a toxina mais internalizado é encaminhado para a lisossomos para degradação, portanto, apenas uma pequena fração da superfície-bound toxina atinge o aparelho de Golgi e ER 6 -12. Para monitorar a translocação da toxina da ER para o citosol em cultura de células, nós combinamos um protocolo de fracionamento subcelular com o highly método de detecção sensível de ressonância plasmon de superfície (SPR) 13-15. A membrana plasmática das células tratadas com a toxina é seletivamente permeabilizadas com digitonina, permitindo cobrança de uma fração citosólica que posteriormente é perfundido durante um sensor de SPR revestido com uma toxina anti-Um anticorpo cadeia. O sensor de anticorpos revestido pode capturar e detectar pg / mL quantidades de toxina citosólica. Com este protocolo, é possível acompanhar a cinética de entrada de toxinas para o citosol e caracterizar efeitos inibitórios sobre o evento de translocação. A concentração de toxina citosólica também pode ser calculado a partir de uma curva padrão gerada com quantidades conhecidas de A cadeia de padrões que foram perfundidos sobre o sensor. Nosso método representa uma resposta rápida, sensível sistema de detecção e quantitativas que não requer marcação radioactiva ou outras modificações à toxina alvo.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Neste relatório, nós descrevemos como ressonância de plasma de superfície é usado para detectar a entrada de toxinas para o citosol host. Este método altamente sensível pode fornecer dados quantitativos sobre a quantidade de toxina citosólica, e pode ser aplicado a uma variedade de toxinas.

Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Imunologia e Infecção

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

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Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...