Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R01 AI073783 a K. Teter. Agradecemos al Dr. Shane Massey para la asistencia en el desarrollo del fraccionamiento subcelular de protocolo y Helen Burress para la lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación de digitonina <ol><li> Añadir 500 l de etanol al 100% a un tubo de microcentrífuga y lo coloca en un bloque de calor fijado en 80 ° C durante 10 min. </li><li> Disolver 2,5 mg de digitonina en 250 l de etanol se calienta para producir una solución de reserva del 1% de digitonina. </li><li> Para generar una solución de trabajo de 0,04% digitonina, agregar 40 ml de la solución madre digitonina a 960 L de HCN buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM de N-ethylmaleimide,...

Comparación con la metodología vigente Nuestra SPR-ensayo basado en la translocación representa un método rápido, sensible y cuantitativo para detectar la entrega toxina en el citosol de acogida. La técnica no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina, y puede ser aplicado a cualquier toxina que un anti-toxina anticuerpo de cadena está disponible. Los métodos existentes para controlar el paso de toxinas en el citosol también se basan en un protocolo de fraccionami...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliósido GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lista </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-hidroxisuccinimida) </td><td> Atravesar </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Etanolamina </td><td> SiGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA anticuerpos </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-PTS1 </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refractómetro </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor de diapositivas </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Jeringa de la bomba </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

Toxinas AB consisten en una subunidad enzimática y una subunidad de unión celular B 1. Estas toxinas son secretadas en el medio extracelular, sino que actúan sobre los objetivos en el citosol eucariota. Algunas toxinas AB viaje por las compañías de vesículas en la superficie celular en el retículo endoplásmico (RE) antes de entrar en el citosol 2-4. En la sala de emergencias, el catalizador se disocia una cadena del resto de la toxina y se mueve a través de un canal proteico-llevar a cabo para alcanzar su objetivo citosólico 5. La translocación, citosólica Una cadena es difícil de detectar porque el tráfico de la toxina a la sala de emergencia es un proceso extremadamente ineficiente: la toxina más interiorizado se dirige a los lisosomas para la degradación, por lo que sólo una pequeña fracción de la superficie con destino toxina alcanza el aparato de Golgi y RE 6 -12. Para controlar la translocación de la toxina de la sala de emergencias para el citosol de las células en cultivo, se combinó un protocolo de fraccionamiento subcelular con los highly método de detección sensible de resonancia de plasmones superficiales (SPR) 13-15. La membrana plasmática de las células de toxinas es tratada de forma selectiva permeabilizadas con digitonina, logrando la recolección de una fracción citosólica, que posteriormente se perfunde en un sensor de SPR recubierto con una toxina anti-un anticuerpo de cadena. El sensor recubiertas de anticuerpos puede capturar y detectar pg / mL cantidades de la toxina del citosol. Con este protocolo, es posible seguir la cinética de entrada de la toxina en el citosol y caracterizar los efectos inhibitorios en el caso de desplazamiento. La concentración citosólica de la toxina también puede ser calculada a partir de una curva estándar generada con cantidades conocidas de una cadena de normas que han sido perfundidos sobre el sensor. Nuestro método consiste en un sistema rápido, detección sensible, cuantitativa y que no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina de destino.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

En este informe, se describe cómo resonancia de plasmones superficiales se utiliza para detectar la entrada de toxinas en el citosol de acogida. Este método altamente sensible puede proporcionar datos cuantitativos sobre la cantidad de toxina citosólica, y puede ser aplicado a una serie de toxinas.

La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

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Los protocolos para la investigación de la distribución original de los tejidos, modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de un anfitrión Densovirus en el gusano de la cápsula del algodón

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

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Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

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Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

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