Name: detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R01 AI073783 till K. Teter. Vi tackar Dr Shane Massey för att få hjälp i utvecklingen av subcellulära fraktionering protokoll och Helen Burress för kritisk läsning av manuskriptet.

1. Beredning av digitonin <ol><li> Tillsätt 500 mikroliter på 100% etanol till ett mikrocentrifugrör och placera den i ett värmeblock inställd på 80 ° C i 10 min. </li><li> Lös 2,5 mg digitonin i 250 mikroliter av den uppvärmda etanol för att producera en 1% stamlösning av digitonin. </li><li> För att generera en fungerande lösning av 0,04% digitonin, tillsätt 40 mikroliter av digitonin stamlösning till 960 mikroliter av HCN buffert (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mm N-Ethyl...

Jämförelse med den befintliga metoden Vår SPR-baserade translokation analysen representerar en snabb, känslig och kvantitativ metod för att upptäcka toxin leverans i den mottagande cytosolen. Tekniken kräver inte radioaktiv inmärkning eller andra ändringar av toxin, och det kan tillämpas på alla toxin som en anti-toxin A-kedjan antikropp är tillgänglig. Befintliga metoder för att övervaka toxin passage i cytosolen bygger också på en subcellulära fraktionering protokoll till u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Ganglioside GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lista </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-Hydroxysuccinimide) </td><td> Pierce </td><td> 24.500 </td></tr><tr><td> EDC (1-Ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22.981 </td></tr><tr><td> Etanolamin </td><td> SIGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA antikropp </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80.747 </td></tr><tr><td> Anti-CTB antikropp </td><td> Calbiochem </td><td> 227.040 </td></tr><tr><td> Anti-PTS1 antikropp </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57.639 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR-sensor diabilder </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Sprutpump </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

AB gifter består av en enzymatisk En subenhet och en cell-bindande B-subenhet 1. Dessa gifter utsöndras i den extracellulära miljön, men de agerar på mål inom eukaryota cytosolen. Vissa AB gifter resa med vesikler transportörer från cellytan till endoplasmatiska retiklet (ER) innan cytosolen 2-4. I ER, för att den katalytiska En kedja dissocierar från resten av toxinet och rör sig genom en protein-ledande kanalen nå sitt cytosoliskt mål 5. Den flyttas, cytosoliskt En kedja är svåra att upptäcka eftersom toxin människohandel till ER är en mycket ineffektiv process: de flesta internaliseras toxin är dirigeras till lysosomer för nedbrytning, så bara en liten del av ytbundet toxin når Golgiapparaten och ER 6 -12. För att övervaka toxin translokation från ER till cytosolen i odlade celler, kombinerade vi en subcellulära fraktionering protokoll med highly känslig metod för ytplasmonresonans (SPR) 13-15. Membranet på toxin-behandlade celler är selektivt permeabilized med digitonin, vilket gör att insamling av en cytosoliskt bråkdel som sedan perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-toxin En kedja antikropp. De antikroppsförsedda sensorn kan fånga och upptäcka pg / ml mängder cytosoliska toxin. Med detta protokoll är det möjligt att följa kinetiken av toxin inträde i cytosolen och för att karakterisera hämmande inverkan på translokation evenemanget. Koncentrationen av cytosolic toxin kan också beräknas från en standardkurva som genereras med kända mängder av en kedja standarder som har perfusion över sensorn. Vår metod är en snabb, känslig och kvantitativ detektionssystem som inte kräver radioaktiv inmärkning eller andra ändringar till målet toxin.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance at JoVE.com

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

I denna rapport beskriver vi hur ytplasmonresonans används för att upptäcka toxin inträde i den mottagande cytosolen. Denna mycket känsliga metoden kan ge kvantitativa uppgifter om mängden cytosolic toxin, och den kan tillämpas på en rad olika gifter.

Detektion av toxin Translokation i den mottagande cytosolen genom Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo avbildning av Transgena Leishmania parasiter i ett Live-värd

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Detektion av infektiösa virus från Field-in Myggor av vero-cellodling analys

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Detektering av invasiv pulmonell aspergillos i hematologiska maligniteter patienter med Lateral-Flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analys av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Ljuddämpning

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detektering av<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant ytglykoprotein Omkoppling av magnetkamera Aktivt cellsortering och flödescytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Protokoll för att undersöka värdvävnads Distribution, Transmission-mode, och påverkan på värd Fitness av ett Densovirus i Cotton bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisande av entrohemoragiska Escherichia Coli koloniseringen i murina mottagande av icke-invasiva In Vivo Mareld System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporal analys av det kärn-till-Cytoplasmatisk translokationen av en Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescerande konfokalmikroskopi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...