Name: dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00
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Die Kollagen-Matrix-Assay wurde entwickelt und durch die Arbeit von vielen verschiedenen Forschergruppen in den letzten zwei bis drei Jahrzehnten verbessert. Die Ansätze hier für striatalen dopaminergen und Explantate beschriebenen stark aus diesen Studien profitieren. Darüber hinaus möchten die Autoren zu Asheeta Prasad für ihre Hilfe danken, bei der Einrichtung von striatalen Explantatkulturen. Arbeit im Labor wurde von der Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award) gefördert, die Niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und Entwicklung (ZonMw-VIDI und ZonMw-TOP), das Europanian Union (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (zu RJP) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (TopTalent; zu ERES).

1. Vorbereitung der Rattenschwanzkollagen <ol><li> Sammle 10.06 erwachsenen Rattenschwänzen (ist es möglich, die Schwänze bei -20 ° C bis zur Verwendung zu speichern). </li><li> Weichen Sie die Schwänze in 95% Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur (RT). </li></ol> Dissektion der Rattenschwänzen (in Gewebekulturen Haube): (Halten Sie Ihre Werkzeuge in 70% Ethanol, wenn nicht mit ihnen und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen, Tools und Glaswaren im Rahmen dieses Verfahrens b...

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	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

Die Kollagenmatrix hier beschriebenen Assay verwendet wurde und von vielen verschiedenen Labors in den letzten Jahrzehnten verbessert, um eine Vielzahl von Axonen Molekülen und neuronalen Systemen untersuchen (zB siehe Referenzen 5-8). Diese Studien haben gezeigt, dass dieser Test ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Wirkungen und Regulation der axonale Wegfindung Moleküle, die durch verschiedene (Zwischen-) Ziel-Geweben sezerniert wird. Es sollte jedoch angemerkt, dass die Kollage...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Fetalem Kälberserum </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Sie Gold-Reagenz Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Tyrosin-Hydroxylase </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Tubulin βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor markierte sekundäre Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

Mittelhirn Dopamin (MDDA) Neuronen Projekt über die mediale Vorderhirnbündel gegen mehrere Bereiche im Telencephalon, einschließlich des Striatum ein. Umgekehrt innervieren Medium stachelige Neuronen im Striatum, die Anlass zur striatonigralen (direkten) Weg geben, die Substantia nigra 2. Die Entwicklung dieser Axonen des ZNS ist abhängig von den Aktionen der kombinatorischen einer Fülle von Axon Wachstum und Führung Cues einschließlich Moleküle, die von Neuriten oder durch (Zwischen-) Ziel-Regionen 3,4 freigesetzt werden. Diese löslichen Faktoren können in vitro durch Kultivieren MDDA und / oder striatalen Explantate in einem Kollagenmatrix, die eine dreidimensionale Substrat für die Axone Nachahmen der extrazellulären Umgebung bietet untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht die Kollagenmatrix für die Bildung von relativ stabilen Gradienten von Proteinen durch andere Explantate oder Zellen in der Umgebung (z. B. siehe Referenzen 5 und 6) angeordnet ist freigegeben. Hier beschreiben wir Verfahren für die PURifizierung von Rattenschwanzkollagen, Mikrodissektion von dopaminergen und striatalen Explantate, ihre Kultur in Kollagen-Gelen und anschließender immunhistochemische und quantitative Analyse. Erstens sind die Gehirne von E14.5 Maus Embryonen isoliert und dopaminerge und striatalen Explantate mikrodissezierten. Diese Explantate werden dann (Co) in Kollagengelen auf Deckgläsern gezüchtet für 48 bis 72 Stunden in vitro. Anschließend sind axonale Projektionen visualisiert mit neuronalen Marker (zB Tyrosin-Hydroxylase, DARPP32 oder βIII Tubulin) und Axon-Wachstum und anziehend oder abstoßend Axon Antworten werden quantifiziert. Diese neuronale Zubereitung ist ein nützliches Werkzeug für die in vitro-Untersuchungen der zellulären und molekularen Mechanismen von mesostriatal und striatonigralen Axonwachstum und Beratung bei der Entwicklung. Mit diesem Test ist es auch möglich, andere (Zwischen-) Ziele für die striatalen dopaminergen und Axonen zu beurteilen oder zu spezifischen molekularen Signale zu testen.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Explantate aus dem Mittelhirn Dopamin und Striatum in einer Kollagenmatrix Assay für die Verwendung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Analyse der mesostriatal und striatonigralen Weg der Entwicklung. In diesem Test axonalen Wachstums und Anleitung können manipuliert und quantifiziert werden. Es kann auch für die Beurteilung der anderen Regionen oder Signalstoffe geändert werden.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Faserverbindungen des Ergänzungsmotorenbereichs Revisited: Methodik der Faserdissektion, DTI und Dreidimensionale Dokumentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...