Name: dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays at JoVE.com

Kollagen matrise analysen har blitt utviklet og forbedret av arbeidet til mange ulike forskningsgrupper i løpet av de siste to-tre tiår. De tilnærminger som beskrives her for dopaminerge og striatale banene explants stor nytte av disse studiene. I tillegg ønsker forfatterne takke Asheeta Prasad for hennes hjelp i å sette opp striatale banene eksplantering kulturer. Arbeid i laboratoriet ble finansiert av Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), den nederlandske organisasjonen for helse Forskning og Utvikling (ZonMW-Vidi og ZonMW-TOP), den Europanian Union (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222 999) (til RJP), og den nederlandske organisasjonen for Scientific Research (TopTalent; til Eres).

1. Utarbeidelse av Rat Tail Collagen <ol><li> Samle 6-10 voksne rotter haler (det er mulig å lagre halene ved -20 ° C til bruk). </li><li> Bløtlegg halene i 95% etanol over natten ved romtemperatur (RT). </li></ol> Disseksjon av rotte haler (i vevskultur hette): (Holde verktøy i 70% etanol når du ikke bruker dem, og sørge for at alle løsninger, verktøy og glass brukes i denne prosedyren er sterilt) <ol start="3"><li> For å samle sener fra halene, avskåret tuppen av...

<ol>
	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

Kollagen matrise analysen beskrives her har blitt brukt og forbedret av mange ulike laboratorier i de siste tiårene for å undersøke en rekke axon veiledning molekyler og nevrale systemer (f.eks se referanser 5-8). Disse studiene har vist at denne analysen er et kraftig verktøy for å studere effekter og regulering av axon veiledning molekyler utskilles av forskjellige (middels) målvevet. Imidlertid bør det bemerkes at kollagen matrisen er en erstatning for den ekstracellulære miljøet...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kalvefoster Serum </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz har L-15 Medium </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Forleng Gold Antifade Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Dialyse tubing </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-tyrosin hydroksylase </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Mus anti-βIII tubulin </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor merket sekundære antistoff </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

Midbrain dopamin (mdDA) nevronene prosjektet via den mediale forebrain bunten mot flere områder i telencephalon, inkludert striatum en. Gjensidig, medium spiny nevroner i striatum som gir opphav til striatonigral (direkte) veien innervate substantia nigra 2. Utviklingen av disse axon traktater er avhengig av kombinatoriske handlingene til en overflod av axon vekst og veiledning pekepinner inkludert molekyler som er utgitt av neurites eller (middels) målrettingsregioner 3,4. Disse løselige faktorer kan studeres in vitro av dyrkning mdDA og / eller striatale banene explants i en kollagen matrise som gir en tredimensjonal substrat for axoner etterligne ekstracellulære miljøet. I tillegg gjør kollagen matrise for dannelsen av relativt stabile gradienter av proteiner utgitt av andre explants eller celler plassert i nærheten (f.eks se referanser 5 og 6). Her beskriver vi metoder for purification av rotte hale kollagen, mikrodisseksjon av dopaminerge og striatale banene explants, deres kultur i kollagen gel og påfølgende immunhistokjemisk og kvantitativ analyse. Først hjernen til E14.5 mus embryoer er isolert og dopaminerge og striatale banene explants er microdissected. Disse explants blir deretter (co) dyrket i kollagen gel på Dekkglass for 48 til 72 timer i vitro. Deretter aksonale anslag er visualisert ved hjelp av nevrale markører (f.eks tyrosin hydroksylase, DARPP32, eller βIII tubulin) og axon vekst og attraktive eller frastøtende axon respons kvantifiseres. Dette neuronal forberedelse er et nyttig verktøy for in vitro studier av cellulære og molekylære mekanismer for mesostriatal og striatonigral axon vekst og veiledning under utvikling. Ved hjelp av denne analysen, er det også mulig å vurdere andre (mellomliggende) mål for dopaminerge og striatale banene axons eller for å teste spesifikke molekylære signaler.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Explants fra midbrain dopamin systemet og striatum brukes i en kollagen matrise analysen for<em&gt; In vitro</em&gt; Analyse av mesostriatal og striatonigral veien utvikling. I denne analysen aksonal utvekst og veiledning kan manipuleres og kvantifiseres. Det kan også endres for å vurdere andre regioner eller molekylære signaler.

Disseksjon og kultur Mouse dopaminerg og striatale banene explants i tredimensjonale kollagen matrise Analyser

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Disseksjon og kultur av Chick Statoacoustic ganglion og Spinal Cord explants i Collagen Gels for neurite utvekst Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

En funksjonell Motor Unit i Kultur Dish: Co-kulturen av ryggmarg explants og muskelceller

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Disseksjon, kultur, og analyse av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Retinal Tissue

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Vurdere nevrodegenerative Fenotyper i<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge nevroner ved å klatre Analyser og Whole Brain farging

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Culture of Mouse dopaminerge nevroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Langsiktig Time Lapse Imaging av Mouse Cochlea eksplantater

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Fiberforbindelser av det kompletterende motorområdet revidert: Metodikk for fiberdisseksjon, DTI og tredimensjonal dokumentasjon

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...