Name: dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00
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El ensayo de matriz de colágeno se ha desarrollado y mejorado por el trabajo de muchos grupos de investigación durante los últimos dos o tres décadas. Los enfoques descritos aquí para explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y se benefician enormemente de estos estudios. Además, los autores desean agradecer a Asheeta Prasad por su ayuda en la creación de culturas del cuerpo estriado de explantes. El trabajo en el laboratorio fue financiado por la organización del programa Human Frontier Science (Premio a la Trayectoria para el Desarrollo), la Organización Holandesa de Investigación en Salud y el Desarrollo (ZonMW-VIDI y ZonMW TOP), la Unión Europanian (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (para RJP), y la Organización Holandesa de Investigación Científica (TopTalent; de ERES).

1. Preparación de colágeno de rata cola <ol><li> Recoger 6-10 colas de rata adulta (es posible almacenar las colas a -20 ° C hasta su uso). </li><li> Remoje las colas en el 95% de etanol durante la noche a temperatura ambiente (RT). </li></ol> La disección de las colas de rata (en la campana de cultivo de tejidos): (Mantener las herramientas en el 70% de etanol, cuando no usarlos y asegúrese de que todas las soluciones, herramientas y material de vidrio se utilizan en este proce...

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	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

El ensayo de matriz de colágeno se describe aquí se ha utilizado y mejorado por muchos laboratorios diferentes en las últimas décadas para investigar una variedad de moléculas de guiado de los axones neuronales y sistemas (por ejemplo, véanse las referencias 5-8). Estos estudios han demostrado que este ensayo es una poderosa herramienta para estudiar los efectos y la regulación de las moléculas de orientación axón secretadas por diferentes tejidos diana (intermedio). Sin embargo, d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina (200 mM) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Mínimos medios esenciales (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz medio L-15 </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reactivo Antifade Oro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Diálisis tubo </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> De conejo anti-tirosina hidroxilasa </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-tubulina βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor etiqueta secundaria de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

La dopamina del cerebro medio (MDDA) neuronas se proyectan a través del haz medial del cerebro anterior hacia varias áreas en el telencéfalo, incluyendo el cuerpo estriado 1. Recíprocamente, las neuronas espinosas medias en el cuerpo estriado que dan lugar a la estriatonigral (directa) y la vía inervan la sustancia negra 2. El desarrollo de estas extensiones del axón depende de las acciones de combinatorias de una gran cantidad de crecimiento de los axones y las señales de orientación que incluyen moléculas que se liberan por neuritas o por regiones de destino (nivel intermedio) de 3,4. Estos factores solubles pueden ser estudiados in vitro por MDDA cultivo y / o explantes estriatales en una matriz de colágeno que proporciona un sustrato tridimensional para los axones que imitan el entorno extracelular. Además, la matriz de colágeno permite la formación de gradientes relativamente estables de proteínas liberadas por explantes otras células y colocados en la proximidad (por ejemplo, véanse las referencias 5 y 6). Aquí se describen los métodos para las comficación de colágeno de cola de rata, microdisección de los explantes dopaminérgicos del cuerpo estriado, y, de su cultura en geles de colágeno y su posterior análisis inmunohistoquímico y cuantitativo. En primer lugar, los cerebros de embriones de ratón E14.5 están aislados y dopaminérgico estriatal y los explantes se microdissected. Estos explantes son entonces (co) cultivadas en geles de colágeno en cubreobjetos de 48 a 72 horas in vitro. Posteriormente, las proyecciones axonales se visualizan utilizando marcadores neuronales (por ejemplo, la tirosina hidroxilasa, DARPP32 o tubulina βIII) y crecimiento de los axones y las respuestas de los axones atractivas o repulsivas son cuantificados. Esta preparación neuronal es una herramienta útil para los estudios in vitro de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones y mesoestriatales estriatonigral y orientación durante el desarrollo. Utilizando este ensayo, también es posible evaluar otros (intermedio) objetivos para los axones dopaminérgicos y estriado o para probar específicos señales moleculares.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Los explantes procedentes del sistema de la dopamina mesencéfalo y el cuerpo estriado se utilizan en un ensayo para la matriz de colágeno<em&gt; In vitro</em&gt; Análisis del desarrollo y la vía mesoestriatales estriatonigral. En este ensayo crecimiento axonal y orientación puede ser manipulado y cuantificados. También se puede modificar para evaluar otras regiones o señales moleculares.

Disección y Cultura de ratón dopaminérgico estriatal en explantes y tridimensionales ensayos matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Conexiones de Fibra del Área de Motor Suplementario Revisited: Metodología de la Dissección de Fibra, DTI, y Documentación Tridimensional

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...