Name: site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃŽÂ¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

Pour Margaret Smith CM d&#39;avoir bien voulu fournir le clone de l&#39;intégrase Le soutien financier de: Génome Canada / Génome Prairie La découverte du CRSNG et des subventions de projets stratégiques

1. La production de la culture <ol><li> Préparer stériles milieux liquides: TY 10 (5 g / l de tryptone, extrait de levure 3 g / l, 0,44 g / l de chlorure de calcium dihydraté), et LB 11 (10 g / l de tryptone, extrait de levure 5 g / l à 5 g / le chlorure de sodium, pH 7). </li><li> Inoculer à partir d&#39;une seule colonie: SmUW227 (S. meliloti LP-souche: la construction sera décrite ailleurs, la souche de détails de construction sont disponibles sur demande) () dans 5 ml de TY m?...

<ol>
	<li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+two+genomes+in+one+cell:+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome.">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li><li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31.">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li><li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering.">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li><li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells.">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li><li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination.">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li><li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li><li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19:+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum.">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li><li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase&#47;invertase+family.">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase&#47;invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li><li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+mobilizable+cosmid+vector,+pRK7813,+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a.">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li><li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum.">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li><li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1.">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li><li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b.">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li><li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules.">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li><li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescence+theatre:+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening.">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li><li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system.">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li><li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations.">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li></ol>

La technique IMCE permet l&#39;intégration efficace d&#39;une cassette d&#39;ADN flanqué attB unique dans le LP-lieu d&#39;une souche auparavant conçu. Une fois la construction désirée est cloné en place de la DP pour créer la cassette des bailleurs de fonds, la technique ne nécessite pas de purification ultérieure de l&#39;ADN et de la transformation, ce qui rend très robuste. Il est essentiel que les contrôles de croissance appropriés sont inclus, pour être certain de la résistance aux ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Streptomycine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> La gentamicine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphénicol </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> Tétracycline </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> Bactériologiques agar de qualité </td><td&gt; Bioshop Canada Inc </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Tryptone </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> Extrait de levure </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Bioshop Canada Inc </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-gluc </td><td> Or Biotechnology Inc </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli MT616 souche </td><td> Disponible sur demande </td><td></td><td> Également utilisé en dehors de notre laboratoire </td></tr><tr><td> E. coli souche pJC2 </td><td> Dans la maison, disponibles sur demande </td><td></td><td></td></tr><tr><td> E. coli souche pJH110 </td><td> Dans la maison, disponible en request </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 souche </td><td> Dans la maison, disponibles sur demande </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)

Le chromosome bactérien peut être utilisé pour maintenir de façon stable l&#39;ADN étranger dans la plage méga-base 1. Intégration dans le chromosome contourne questions comme la réplication du plasmide, le plasmide de la stabilité, incompatibilité plasmidique, et le plasmide de la variance du nombre de copies. Cette méthode utilise l&#39;intégrase spécifique de site à partir du phage Streptomyces (Φ) C31 2,3. L&#39;intégrase catalyse une recombinaison ΦC31 direct entre deux sites d&#39;ADN spécifiques: attB et attP (34 et 39 pb, respectivement) 4. Cette recombinaison est stable et ne pas revenir 5. Un &quot;piste&quot; (LP) de séquence constitué par un gène de résistance à la spectinomycine-, aadA (SpR), et le E. coli ß-glucuronidase gène (uidA) flanqué par des sites attP a été intégré dans les chromosomes de Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi et Agrobacterium tumefaciens dans une région intergénique, l&#39;ampC locus, et le locus tetA, respectivement. S. meliloti est utilisé dans ce protocole. Vecteurs donateurs mobilisables contenant des sites attB flanquant un stuffer protéine fluorescente rouge (RFP) gène et un gène de résistance aux antibiotiques ont également été construits. Dans cet exemple la gentamicine pJH110 plasmide de résistance est utilisé. Le gène DP 6 peuvent être remplacés par une construction souhaité à l&#39;aide Sph I et Pst I. Sinon, une construction synthétique flanqué par des sites attB peut être sous-cloné dans un vecteur mobilisable comme pK19mob 7. L&#39;expression du gène de l&#39;intégrase ΦC31 (cloné à partir d&#39;pHS62 8) est entraîné par le promoteur lac, sur une large gamme d&#39;hôtes mobilisable plasmide pRK7813 9. Un protocole d&#39;accouplement tetraparental est utilisé pour transférer la cassette des bailleurs de fonds dans la souche LP remplaçant ainsi les marqueurs dans la séquence LP avec la cassette des bailleurs de fonds. Ces cellules sont trans-intégrants. Trans-intégrants sont formées avec un rendement typique de 0,5%. Trans-intégrants se trouvent généralement dans les premières colonies 500-1000 dépistées par la sensibilité aux antibiotiques ou bleu-blanc de dépistage utilisant le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-acide glucuronique (X-gluc). Ce protocole contient les procédures d&#39;accouplement et de sélection pour la création et l&#39;isolement de trans-intégrants.

Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃŽÂ¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃƒÅ½Ã‚Â¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE

Une méthode rapide et efficace d&#39;intégrer l&#39;ADN étranger dans des souches d&#39;intérêt accepteurs pré-faites, dites souches piste d&#39;atterrissage, est décrite. Procédé permettant d&#39;intégration spécifique de site d&#39;une cassette d&#39;ADN dans le locus piste d&#39;ingénierie d&#39;une souche donnée, par conjugaison et l&#39;expression de l&#39;intégrase ΦC31.

Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Procedure for Lung Engineering

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Recherche

Bio-ingénierie

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Caractériser Volatiles bactérienne secondaire à l&#39;aide d&#39;ionisation électrospray spectrométrie de masse (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l&#39;aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Observation et quantification du compactage du gel de fibrine médié par les fibroblastes

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthèse d&#39;une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

Fabrication robuste préformes à fibres naturelles Utilisant bactérienne Cellulose Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologiquement Induced Précipitation de calcite Mediated par<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Génie tissulaire par Intrinsic vascularisation dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Chambre Ingénierie

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Microfluidique Buffer Exchange pour sans interférence Micro / Nanoparticules ingénierie cellulaire

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...