Name: site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃŽÂ¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

כדי מרגרט סי סמית עבור חביב מתן שיבוט integrase גיוס תמיכה של: הגנום קנדה / הגנום Prairie NSERC גילוי מענקים פרויקט אסטרטגי

1. הפקה של תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת נוזלי סטריליים: TY במילה 10 (5 גר &#39;/ ליטר tryptone, 3 גר&#39; / ליטר תמצית שמרים, 0.44 גר &#39;/ ליטר כלוריד מייבשים סידן), וכן 11 LB (10 גר&#39; / ליטר tryptone, 5 גר &#39;/ ליטר תמצית שמרים, 5 גר&#39; / נתרן כלורי, pH...

<ol>
	<li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+two+genomes+in+one+cell:+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome.">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li><li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31.">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li><li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering.">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li><li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells.">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li><li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination.">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li><li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li><li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19:+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum.">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li><li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase&#47;invertase+family.">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase&#47;invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li><li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+mobilizable+cosmid+vector,+pRK7813,+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a.">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li><li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum.">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li><li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1.">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li><li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b.">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li><li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules.">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li><li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescence+theatre:+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening.">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li><li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system.">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li><li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations.">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li></ol>

הטכניקה IMCE מאפשר שילוב יעיל של קלטת ה-DNA בודד מוקף attB לתוך לוקוס-LP של זן מהונדס בעבר. ברגע מבנה הרצוי משובט במקום RFP ליצור את הקלטת התורם, הטכניקה אינה דורשת טיהור שינוי ה-DNA עתידיים, מה שהופך אותו מאוד חזקים. זה קריטי, כי בקרות מתאימות הצמיחה כלולות, כדי להיות ב?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> אגר כיתה בקטריולוגית </td><td&gt; Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Tryptone </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום כלוריד </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> Bioshop קנדה בע&quot;מ </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-gluc </td><td> גולד ביוטכנולוגיה בע&quot;מ </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli MT616 זן </td><td> ניתן להזמין </td><td></td><td> משמש גם מחוץ למעבדה שלנו </td></tr><tr><td> E. coli pJC2 זן </td><td> בבית, זמין לפי בקשה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> E. coli pJH110 זן </td><td> בבית, זמין על ידי requesלא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 זן </td><td> בבית, זמין לפי בקשה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)

כרומוזום חיידקי ניתן להשתמש כדי לשמור על דנ&quot;א זר ביציבות בטווח מגה בסיס 1. אינטגרציה לתוך הכרומוזום עוקף בעיות כגון שכפול הפלסמיד, יציבות הפלסמיד, אי התאמה פלסמיד, ושונות פלסמיד מספר עותק. שיטה זו משתמשת integrase באתר ספציפי של הפאג Streptomyces (Φ) C31 2,3. Integrase ΦC31 מזרז רקומבינציה ישירה בין שני אתרי DNA ספציפיים: attB ו attP (34 ו - 39 נ&quot;ב, בהתאמה) 4. רקומבינציה זו יציבה ולא לחזור 5. &quot;משטח נחיתה&quot; (LP) הרצף המורכב של הגן spectinomycin עמידות, aadA (SPR), וכן א &#39; SS-coli glucuronidase גן (uidA) מוקף אתרים attP שולב הכרומוזומים של Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, ו tumefaciens Agrobacterium באזור intergenic, אניPC לוקוס, ואת מוקד תטא, בהתאמה. ס meliloti נעשה שימוש בפרוטוקול זה. וקטורים התורמות Mobilizable המכילים אתרי attB משני צדי אדום stuffer חלבון פלואורסצנטי (RFP) גנים גן עמידות לאנטיביוטיקה יש גם לבנות. בדוגמה זו pJH110 גנטמיצין פלסמיד עמיד משמש. הגן RFP 6 עשוי להחליף את המבנה הרצוי באמצעות SPH אני Pst א לחלופין מבנה סינתטי מוקף אתרים attB יכול להיות תת משובטים לתוך וקטור mobilizable כגון pK19mob 7. הביטוי של הגן ΦC31 integrase (משובטים מ pHS62 8) הוא מונע על ידי האמרגן לאק, על מגוון רחב מארח mobilizable פלסמיד pRK7813 9. פרוטוקול ההזדווגות tetraparental משמש להעברת קלטת התורם אל זן LP ובכך להחליף את סמני ברצף LP עם קלטת התורם. תאים אלה הם טראןS-integrants. טרנס integrants נוצרים ביעילות אופיינית של 0.5%. טרנס integrants נמצאות בדרך כלל בתוך 500-1,000 מושבות הראשונים שהוקרנו על ידי רגישות לאנטיביוטיקה או כחול לבן ההקרנה באמצעות 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl-beta-D-glucuronic חומצה (X-gluc). פרוטוקול זה מכיל את ההזדווגות ובחירת נהלים ליצירה בידוד טרנס integrants.

Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃŽÂ¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃƒÅ½Ã‚Â¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ&quot;א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Procedure for Lung Engineering

נוהל הנדסה ריאות

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

נדיפים חיידקית משנית אפיון באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

ייצור של תבניות ייצרו מראש חזקות סיבים טבעיים ניצול קטריאלי תאית כמו בינדר

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

מיקרוביולוגי מושרה קלציט רטיבות בתיווך<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...