Name: site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃŽÂ¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

Для Маргарет Смит CM за любезно предоставленные интегразы клон Финансирование поддержки: Геном Канада / Геном Prairie NSERC Discovery и стратегических проектов гранты

1. Производство культуры <ol><li> Подготовка стерильных жидких сред: TY 10 (5 г / л триптон, 3 г / л дрожжевого экстракта, 0,44 г / л хлорида кальция обезвоживания) и LB 11 (10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / хлорид натрия, рН 7). </li><li> Инокулировать из одной колонии: SmUW227 (С. meliloti</...

<ol>
	<li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+two+genomes+in+one+cell:+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome.">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li><li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31.">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li><li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering.">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li><li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells.">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li><li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination.">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li><li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li><li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19:+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum.">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li><li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase&#47;invertase+family.">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase&#47;invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li><li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+mobilizable+cosmid+vector,+pRK7813,+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a.">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li><li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum.">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li><li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1.">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li><li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b.">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li><li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules.">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li><li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescence+theatre:+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening.">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li><li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system.">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li><li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations.">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li></ol>

IMCE техника позволяет эффективно интегрировать одного attB окружении ДНК кассету в LP-локус ранее инженерии штамм. Как только желаемый конструкция клонированных вместо ППП для создания доноров кассеты, техника не требует последующей очистки ДНК и трансформации, что делает его о...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Стрептомицин </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Спектиномицин </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> Гентамицин </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> Тетрациклин </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Канамицин </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> Бактериологическое качество агара </td><td&gt; Bioshop Канада Инк </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Триптон </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> Дрожжевой экстракт </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> Хлористый натрий </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> Хлорид кальция </td><td> Bioshop Канада Инк </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-Gluc </td><td> Золото Биотехнологии Инк </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> Кишечной палочки штамма MT616 </td><td> Предоставляется по запросу </td><td></td><td> Также используется за пределами нашей лаборатории </td></tr><tr><td> Кишечной палочки штамма pJC2 </td><td> В доме, предоставляется по запросу </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Кишечной палочки штамма pJH110 </td><td> В доме, доступных по требовант </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 деформации </td><td> В доме, предоставляется по запросу </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)

Бактериальной хромосомы могут быть использованы для поддержания стабильно чужеродной ДНК в мега-база от 1. Интеграция в хромосому обходит такие вопросы, как плазмиды репликации плазмиды стабильности, плазмиды несовместимости, и плазмиды дисперсии числа копий. Этот метод использует сайт-специфические интегразы из Streptomyces фага (Φ), C31 2,3. ΦC31 интегразы катализирует прямой рекомбинации между двумя определенными участками ДНК: attB и attP (34 и 39 б.п. соответственно), 4. Это рекомбинация является стабильной и не возвращается 5. &quot;Посадочная площадка&quot; (LP) последовательность, состоящая из спектиномицину ген устойчивости, Aada (СРП), и Е. палочки бета-глюкуронидазы ген (uidA) в окружении сайтов attP была интегрирована в хромосомах Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi и Agrobacterium tumefaciens в межгенных региона, утрапКл локус, и тета локус, соответственно. С. meliloti используется в данном протоколе. Mobilizable векторы донора содержащие attB сайтов фланговые писака красный флуоресцентный белок (RFP) гена и гена устойчивости к антибиотикам, также были построены. В этом примере гентамицина устойчивы плазмиды pJH110 используется. Ген RFP 6 может быть заменен на желаемую конструкцию использованием Sph я и Pst I. Кроме того синтетическая конструкция в окружении attB сайты могут быть суб-клонирован в вектор mobilizable таких как pK19mob 7. Выражение ΦC31 интегразы гена (клонированы из pHS62 8) приводится в движение промоутер лак на mobilizable широкий спектр хозяин плазмиды pRK7813 9. Tetraparental протокола спаривания используется для передачи доноров кассету в LP штамм тем самым заменив маркеры в последовательности LP с донорами кассету. Эти клетки являются переходыS-интегрантов. Транс-интегрантов формируются с типичной эффективностью 0,5%. Транс-интегрантов которые обычно встречаются в первые 500-1000 колонии экранируется чувствительность к антибиотикам или сине-белые скрининга с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновой кислоты (X-Gluc). Этот протокол содержит спаривания и процедуру отбора для создания и выделения транс-интегрантов.

Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃŽÂ¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: ÃƒÅ½Ã‚Â¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE

Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.

Сайт-специфическая бактериальная хромосома Инженерно: ΦC31 интегразы опосредованная кассеты бирже (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Procedure for Lung Engineering

Порядок легких инженерных

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Характеризуя Бактериальные Летучие использованием вторичного Электроспрей ионизации масс-спектрометрия (СЕСИ-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Высокая эффективность, определенных сайтов Трансфекция прилипшие клетки с помощью миРНК Микроэлектродные массивы (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Капиллярная сила Литография для сердечной тканевой инженерии

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Наблюдение и количественная оценка Фибробластовой Фибрин Гель Компактион

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

Производство надежных натуральное волокно заготовок с использованием бактериальной целлюлозы в качестве связующего

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Микробиологически Индуцированные кальцит Осадки опосредованная по<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Тканевая инженерия по искробезопасности васкуляризации<em&gt; В Vivo</em&gt; Tissue Engineering палата

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Микрожидкостных буфера обмена для Помехоустойчивое Micro / клеточной инженерии наночастиц

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...