Name: the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry
Uploaded: 2012-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytomet

Este trabalho foi suportado pelo financiamento da Fundação Overstreet.

1. Configuração básica antes de prosseguir para Cultura Celular <ol><li> NeuroCult Médio NSC basal e Suplementos NeuroCult NSC proliferação, são misturados a uma proporção de 9:1, respectivamente, para fazer médio NSC completa. </li><li> A 37 ° C banho de água é usada para aquecer o meio. </li><li> Quantidade apropriada de inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) é descongelado. </li><li> Quantidade apropriada de soluções de reserva do factor de crescimento incluindo o factor de crescimento epi...

<ol>
	<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).</li><li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells.">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li><li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis.">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li><li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient.">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li></ol>

A capacidade de isolar populações definidas de células neurais (neurônios, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos) pode resolver alguns dos impedimentos associados à aplicação clínica de células-tronco neurais (NSCs). Em primeiro lugar, permite-nos para caracterizar completamente a população inicial de células do doador. Em segundo lugar, nos permite usar um tipo particular de célula ou uma combinação de diferentes tipos de células com um rácio específico, dependendo da natureza ou da fase da doença...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> NeuroCult Médio NSC Basal </td><td> Médio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Suplementos Proliferação </td><td> Suplemento de meio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina de soja </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> Componente HEM </td></tr><tr><td> * Os HEPES </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Componente HEM </td></tr><tr><td> * A água destilada </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> Peneira </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 balão </td><td> Cultura louça </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 balão </td><td> Cultura louça </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubos </td><td> Cultura louça </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Cultura louça </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Fator de crescimento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituído em PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Anticorpo </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugado IgG1 rato </td><td> Isotipo de anticorpo de controlo </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Fator de crescimento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituído em PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Fator de crescimento </td><td> R &amp; D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-Ornithine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo </td><td> Suplemento Médio </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Anticorpo </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III tubulina </td><td> Anticorpo </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Para fazer HEM, mistura 1 x pacote L 10 de MEM e 160 ml de HEPES 1M e levar o volume a 8,75 L com água destilada. Ajuste o pH final para 7,4 e armazená-lo a 4 ° C.

the neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry

As células estaminais neurais (NCCC) podem ser isoladas e expandidas em grande escala, utilizando o ensaio de neuroesfera e diferenciados para as três principais tipos de células do sistema nervoso central (SNC), ou seja, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. Estas características tornam haste neural e células progenitoras uma valiosa fonte renovável de células para estudos in vitro, como o rastreio de drogas, neurotoxicologia e electrofisiologia e também para a terapia de substituição de células em muitas doenças neurológicas. Na prática, contudo, a heterogeneidade da NSC descendência, baixa produção de neurónios e oligodendrócitos, e uma predominância de astrócitos seguintes diferenciação limitar as suas aplicações clínicas. Aqui, descrevemos uma nova metodologia para a purificação e posterior geração de neurônios imaturos da descendência NSC murino usando separação de células activadas por fluorescência (FACS) da tecnologia. Utilizando esta metodologia, uma população altamente enriquecida de células neuronais progenitoras pode ser conseguida witHout qualquer astrócitos perceptível e bona fide contaminação NSC. O procedimento inclui a diferenciação de NSC progenitura isoladas e expandidas a partir de E14 eminências rato ganglionares utilizando o ensaio neuroesfera, seguido por isolamento e enriquecimento de células neuronais imaturos com base nas suas propriedades físicas (tamanho e complexidade interna) e fluorescente utilizando a tecnologia de citometria de fluxo. Em geral, leva-se 5-7 dias para gerar neuroesferas e 6-8 dias para diferenciar progenitura NSC e isolar altamente purificada imaturos células neuronais.

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The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Enumeração de células-tronco neurais Usando clonais Ensaios

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...