Name: multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting at JoVE.com

Het hier gepresenteerde onderzoek werd ondersteund door Charles River.

<ol>
	<li>Jacobson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+validation+of+diagnostic+assays+for+infectious+diseases.">Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases.</a> Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. , 8-15 (1996).</li><li>Wright, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+standards+for+test+methods+and+reference+sera+for+diagnostic+tests+for+antibody+detection.">International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection.</a> Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 17 (2), 527-533 (1998).</li><li>Pepe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , (2003).</li><li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection.">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li></ol>

Alle auteurs werken voor Charles River RADS, een belangrijke leverancier van dierlijke serologie testen en reagentia.

De MFIA testproces is zeer efficiënt, die minder apparatuur en kleinere monster en reagens volumes dan de traditionele singleplex tests. De functionaliteit van het multiplex systeem geeft de gebruiker de flexibiliteit om gelijktijdig screenen van meerdere serotypen of stammen van gemeenschappelijke middelen in laboratorium-knaagdieren (bijvoorbeeld Coronavirus, parvovirussen etc.). Dit stelt ons voor afgestemde bead panelen ontwerpen gebaseerd op het interessegebied (dwz specifieke virusfamilie) en is aanpasbaar aan screening andere biomoleculen zoals cytokines en andere biomarkers. Daarnaast kunnen we een aantal interne controle assays te nemen om te proeven en het systeem geschiktheid te controleren en daarmee zorgen voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Deze omvatten weefsel controle en IgG-anti-testserum soorten immunoglobuline (αIg) gecoat parel sets te proeven geschiktheid te evalueren. Een weefsel controlekorrel detecteert niet-specifieke binding van serum immunoglobuline en αIg bead control bevestigtdat serum is toegevoegd en bevat een voldoende concentratie immunoglobuline. Een andere controle kraal, bekleed met serum soorten immunoglobuline, toont aan dat de gelabelde reagentia en analyse lezer naar behoren functioneren. Andere in de handel verkrijgbare multiplex formaat serologische assays (bijv. microarrays, Immunocomb) mag niet bieden deze hetzelfde niveau van resultaat bevestiging. De mogelijkheid om een ​​beperking van de mogelijke bron van test falen voorafgaand aan de nacontrole kan helpen een onderzoeker besparen op tijd en materiaal. Kritische aspecten van het MFIA moet worden bevestigd voordat men een mislukte monster. Aangezien de test wordt uitgevoerd bij omgevingstemperatuur moet worden nagegaan of het laboratorium temperatuur ongeveer 27 ° C ± 2 ° C, hogere temperaturen kan leiden tot lager dan verwachte scores voor controles en monsters. Wassen is wellicht de meest kritische stap in de assay. Verzekeren dat de testplaat goed gewassen, afgevloeid en geresuspendeerd kan eliminerende meeste steekproeffouten door lage bead count (door geaggregeerde kralen) of onvoldoende reagens (verloren wicking van testplaat filterbodem). We routinematig tellen 25 kralen per assay (agent) en hebben geen statistisch verschil in de resultaten op te tellen groter aantal kralen die ook leidt tot een langere leestijd voor de plaat. Wij hebben uitgebreide validatie studies van MFIA op verschillende soorten van de meest gebruikte proefdieren (muis, rat, hamster, cavia en konijn) om diagnostische nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en robuustheid aan te tonen door het testen van grote aantallen bekende positieve en negatieve serummonsters, en vergelijking van de ELISA, IFA en MFIA resultaten. De detectiegrenzen (bijvoorbeeld standaard immune serum titratie eindpunten) van MFIA waren vergelijkbaar met, en in sommige gevallen overtrof, bij overeenkomstige ELISA. Diagnostische specificiteit, gemeten met SPF knaagdier sera, meer dan 99%, de totale correspondentie between ELISA en MFIA uitgevoerd op bekende positieve en negatieve sera bekende bedroeg meer dan 95%. Kortom, deze resultaten bleek dat multiplex MFIA is een goed alternatief voor de singleplex ELISA, en is geschikt voor het beoogde gebruik, dat wil zeggen in de routine serologische tests van laboratorium dieren kolonies.

multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting

Om de kwaliteit van diermodellen gebruikt bij biomedisch onderzoek dat we hebben een aantal diagnostische teststrategieën en methoden te bepalen of dieren blootgesteld aan onvoorziene infectieuze agentia (virussen, mycoplasma en andere veeleisende micro-organismen). Infecties van immuuncompetente dieren zijn over het algemeen van voorbijgaande aard, maar toch serumantistofresponsen voor infecties vaak kunnen worden opgespoord binnen enkele dagen tot weken aanhouden en gedurende de gehele levensduur van de gastheer. Serologie is de primaire diagnostische methode waarmee proefdieren worden gecontroleerd. Historisch de indirecte enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is de belangrijkste screeningswerkwijze voor serologische tests. De ELISA wordt uitgevoerd als een singleplex, waarin een microbiële antigen-antilichaam reactie wordt per well gemeten. In vergelijking de MFIA uitgevoerd als een gemultiplexte assay. Aangezien de microsferen zijn in 100 verschillende kleurenschema&#39;s kunnen wel 100 verschillende assays worden uitgevoerd simultaaneously in een microplaat goed. Deze innovatie vermindert de hoeveelheid serum, reagentia en disposables vereist voor routinetests terwijl de hoeveelheid van informatie uit een monsterkamer. Daarnaast zijn wij in staat om meerdere interne controle kralen te nemen om te proeven en het systeem geschiktheid te controleren en daarmee zorgen voor de nauwkeurigheid van de resultaten. Deze omvatten weefsel controle en IgG-anti-testserum soorten immunoglobuline (αIg) gecoat parel sets te proeven geschiktheid te evalueren. Zoals in de ELISA en IFA, de weefselcontrole detecteert niet-specifieke binding van serum immunoglobuline. De αIg controle (Serum controle) bevestigt dat serum is toegevoegd en bevat een voldoende immunoglobuline concentratie terwijl de IgG-controle kraal (System Geschiktheid controle), bekleed met serum soorten immunoglobuline, toont aan dat de gelabelde reagentia en Luminex lezer naar behoren functioneren.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting at JoVE.com

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Met behulp van Luminex Corporation xMAP microsfeer technologie, hebben we de multiplexverzending fluorometrische immunoassay (MFIA) voor serologische tests van de verschillende proefdier. De MFIA een suspensie microarray waar antigen, weefselcontrole of immunoglobulinen covalent gekoppeld aan gekleurde polystyreen microsferen. De MFIA testmethode, evenals verschillende onderwerpen voor problemen oplossen is gericht.

Multiplexed fluorometrische Immunoassay Methodiek en problemen oplossen

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Polymerase Chain Reaction: Basis Protocol Plus Problemen oplossen en Optimalisatie Strategieën

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van &quot;Veiligheid Catch&quot; Methodologie

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Ontwerp en gebruik van multiplexverzending chemostaat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Een gevoelige en specifieke kwantificering Methode voor het bepalen van Serum cardiale myosine bindend eiwit C door elektrochemiluminescentie-Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Procedure en belangrijkste optimalisatie strategieën voor een geautomatiseerde capillaire elektroforetische gebaseerde Immunoassay-methode

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...