Name: multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
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	<li>Jacobson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+validation+of+diagnostic+assays+for+infectious+diseases.">Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases.</a> Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. , 8-15 (1996).</li><li>Wright, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+standards+for+test+methods+and+reference+sera+for+diagnostic+tests+for+antibody+detection.">International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection.</a> Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 17 (2), 527-533 (1998).</li><li>Pepe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , (2003).</li><li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection.">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li></ol>

チャールズ川RADS、動物血清学検査サービスおよび試薬の主要なプロバイダのすべての著者が仕事。

MFIAのテストプロセスは、従来のsingleplexテストより少ない機器や小​​さいサンプルと試薬を正確な容量を必要とする、非常に効率的です。多重システムの機能は、実験用げっ歯類における共通エージェントの複数の株または血清（すなわち、コロナウイルス、パルボウイルスなど）を同時にスクリーニングするために、ユーザに柔軟性を提供します。これはまた、関心のある領域（すなわち、特定のウイルスの家族）に基づいてカスタマイズされたビーズのパネルを設計するために、私たちを可能にし、サイトカインおよび他のバイオマーカーを含む生体分子の他の種類のスクリーニングに適応可能です。また、それは私たちがサンプルおよびシステム適合性を確認することにより、結果の精度を保証するために、いくつかの内部統制アッセイを組み込むことができます。これらはサンプルの適合性を評価するための組織制御とIgG抗血清試験種の免疫グロブリン（αIg）でコーティングされたビーズセットが含まれています。組織制御ビードは血清免疫グロブリンの非特異的結合を検出し、αIgビードコントロールが確認その血清を添加し、十分な免疫グロブリン濃度が含まれているされています。血清種の免疫グロブリンでコーティングされた別のコントロールビーズは、標識された試薬及びアッセイリーダーが正常に機能していることを示しています。他の市販の多重フォーマット血清学的アッセイは、（つまり、マイクロアレイ、ImmunoComb）結果確認のこの同じレベルを提供しません。 前に再テストをアッセイ失敗の可能性のあるソースを絞り込むために能力は研究者が時間と材料を節約することができます。 MFIAの重要な側面は、失敗したサンプルを繰り返す前に確認すべきである。アッセイは、周囲温度で行われるので、それは℃±2℃、高温がコントロールとサンプルの予想より低いスコアにつながることができます約27実験室の温度であることを確認する必要があります。洗濯は、おそらく検定の中で最も重要なステップです。試験板を適切に洗浄されることを保証する、ブロットし、排除することができます再懸低ビーズカウント（集約ビーズのために）または不十分な試薬添加（試験板フィルター底から吸い上げによって失われた）のためにサンプリング誤差の大半。我々は日常的にアッセイ当たり25ビーズ（エージェント）を数え、また、プレートのための時間を読むために長くつながるビーズの高い数を数えることによって、結果に有意差は認められません。 我々は、既知の陽性及び陰性血清多数のサンプルをテストすることにより、診断精度、再現性、耐久性を実証するために一般的に使用される実験動物の数種（マウス、ラット、ハムスター、モルモット及びウサギ）でMFIAの包括的な検証試験を行い、き彼らのELISA、IFAおよびMFIA結果を比較する。 MFIAの検出限界（すなわち、標準的な免疫血清滴エンドポイント）が同程度であった、といくつかのケースでは、対応するELISA法を上回りました。 SPFの齧歯類の血清を用いて測定し診断特異性は、99％を超え、全体の対応betwee既知の陽性および既知の陰性血清で行わnのELISAとMFIAは95％以上であった。要約すると、これらの結果は、多重MFIAがsingleplex ELISAと良い代替であり、実験動物コロニーのルーチンserosurveillanceすなわち、その使用目的に適していることを証明した。

multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting

生物医学研究に使用される動物モデルの品質を確保するために、我々は動物が外来性感染性病原体（ウイルス、マイコプラズマ、および他の潔癖な微生物）にさらされているかどうかを判断するための診断テスト戦略と方法を開発しました。免疫担当動物の感染症は、一般的に一時的なもので、まだ感染に対する血清抗体応答は、しばしば数日から数週間以内に検出することができ、ホストの寿命を通じて存続する。血清学的検査は、実験動物を監視する主要な診断方法である。歴史的には間接的な酵素免疫測定法（ELISA）はserosurveillanceのための主要なスクリーニング方法であった。 ELISAは、1つの微生物抗原抗体反応をウェル当たり測定される、singleplexとして実行されます。比較でMFIAは多重化アッセイとして実行されます。ミクロス100個別の色セットになっているので、最大100の異なるアッセイがsimultanを行うことができますeouslyシングルマイクロプレートのウェル。この技術革新はよく単一の試験から得られた情報の量を増加させながら、ルーチン検査に必要な血清、試薬および消耗品の量を減少させる。加えて、我々は、サンプルおよびシステム適合性を確認することにより、結果の精度を保証するために、複数の内部統制ビーズを取り込むことが出来るのです。これらはサンプルの適合性を評価するための組織制御とIgG抗血清試験種の免疫グロブリン（αIg）でコーティングされたビーズセットが含まれています。 ELISAとIFAのように、組織のコントロールは、血清免疫グロブリンの非特異的結合を検出します。 αIg制御（血清コントロール）は、血清が追加されたことを確認し、血清種の免疫グロブリンでコーティングされたIgGコントロールビーズ（システム適合性制御）は、標識試薬およびLuminexの読​​者が正しく機能していることを示していながら、十分な免疫グロブリン濃度が含まれています。

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Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。 MFIA試験法だけでな​​く、様々なトラブルシューティングのトピックが扱われています。

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

ポリメラーゼ連鎖反応：基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を &quot;安全キャッチ&quot;を使用して

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

多重ケモスタットアレイの設計および使用

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

プロシージャおよび自動キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法のためのキーの最適化戦略

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...