Name: multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting at JoVE.com

A pesquisa apresentada aqui foi apoiado por Charles River.

<ol>
	<li>Jacobson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+validation+of+diagnostic+assays+for+infectious+diseases.">Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases.</a> Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. , 8-15 (1996).</li><li>Wright, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+standards+for+test+methods+and+reference+sera+for+diagnostic+tests+for+antibody+detection.">International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection.</a> Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 17 (2), 527-533 (1998).</li><li>Pepe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , (2003).</li><li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection.">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li></ol>

Todo o trabalho de autores por Charles River RADS, um importante fornecedor de serviços de sorologia em animais de testes e reagentes.

O processo de teste MFIA é altamente eficiente, que requer menos equipamento e menores volumes de amostra e de reagente do que os testes tradicionais singleplex. A funcionalidade do sistema de multiplex dá ao utilizador a flexibilidade para rastrear simultaneamente por várias estirpes ou serotipos de agentes comuns em roedores de laboratório (Coronavirus ie, parvovírus, etc.) Isto também permite, de concepção personalizada painéis grânulo com base na área de interesse (ou seja, a família de vírus específico) e é adaptável a outros tipos de triagem de biomoléculas, incluindo citocinas e outros biomarcadores. Além disso, permite-nos incorporar vários ensaios de controlo interno a fim de verificar a adequação do sistema de amostra e e, assim, garantir a precisão dos resultados. Estes incluem o controlo de tecido e ensaio de IgG anti-imunoglobulina de espécies de soro (αIg) conjuntos de esferas revestidas para avaliar a adequação da amostra. Um tecido de controlo do grânulo detecta a ligação não específica de imunoglobulina do soro e a esfera de controlo αIg confirmaque o soro foi adicionado e contém uma concentração de imunoglobulina suficiente. Outra grânulo de controlo, revestidas com imunoglobulina de espécies de soro, demonstra que os reagentes marcados e leitor de ensaio estão a funcionar correctamente. Outros comercialmente disponíveis multiplex ensaios formato sorológicos (microarrays ie, ImmunoComb) pode não oferecer o mesmo nível de confirmação de resultado. A habilidade para diminuir a possível fonte de fracasso ensaio antes de reteste pode ajudar o pesquisador economizar em tempo e materiais. Aspectos críticos do MFIA deve ser confirmada antes de repetir uma amostra falhou. Uma vez que o ensaio é realizado à temperatura ambiente, deve-se verificar que a temperatura de laboratório é de cerca de 27 ° C ± 2 ° C, as temperaturas mais elevadas podem conduzir a uma redução do que esperado para controlos e amostras. Lavagem é, talvez, o passo mais importante no ensaio. Garantindo que a placa de teste é devidamente lavado e ressuspenso blotted pode eliminara grande maioria dos erros de amostragem, devido à baixa contagem de talão (devido esferas de agregados) ou a adição de reagente insuficiente (perdido por capilaridade para fora da parte inferior da placa de ensaio do filtro). Rotineiramente contar 25 pérolas por ensaio (agente) e não encontraram nenhuma diferença estatística nos resultados por contagem maior número de pérolas que também conduzem a um maior tempo de leitura para a placa. Realizamos estudos de validação abrangentes de MFIA em várias espécies de animais de laboratório comumente utilizados (camundongo, rato, hamster, porquinhos e coelho) para demonstrar a precisão diagnóstica, reprodutibilidade e robustez, testando um grande número de conhecidos positivos e negativos amostras de soro, e comparando sua ELISA, IFA e resultados MFIA. Os limites de detecção (isto é, o padrão de titulação de soro imune endpoints) de MFIA foram comparáveis, e em alguns casos ultrapassou, os de ELISA correspondente. Especificidade do diagnóstico, medida com roedores SPF soros, superou 99%, o betwee correspondência geraln ELISA e MFIA realizada em conhecidos soros positivos e negativos conhecidos foi superior a 95%. Em resumo, estes resultados mostraram que MFIA multiplex é um bom substituto para o ELISA singleplex, e é adequada para a sua pretendida utilização, ou seja, em serovigilância rotina de colónias de animais laboratoriais.

multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting

Para assegurar a qualidade dos modelos animais utilizados em pesquisa biomédica, temos desenvolvido um número de estratégias de ensaio e métodos de diagnóstico para determinar se os animais foram expostos a agentes infecciosos adventícias (vírus, micoplasmas e outros microorganismos aeróbios). Infecções de animais imunocompetentes são geralmente transitórios, mas as respostas de anticorpos séricos a infecção, muitas vezes pode ser detectado dentro de dias a semanas e persistir durante toda a vida do hospedeiro. Serologia é a metodologia de diagnóstico primário pelo qual os animais de laboratório são monitorizados. Historicamente, o ensaio com enzima ligada indirecto (ELISA) foi o principal método de rastreio para serovigilância. O ELISA é realizado como uma singleplex, em que uma reacção antigénio-anticorpo microbiana é medida por poço. Em comparação a MFIA é realizado como um ensaio multiplex. Uma vez que as micro-esferas entram em 100 conjuntos de cores distintas, até 100 diferentes ensaios podem ser realizados Simultaneously numa única microplaca bem. Esta inovação diminui a quantidade de soro, os reagentes e produtos descartáveis ​​requeridos para testes de rotina, enquanto que aumentando a quantidade de informação obtida a partir de um único teste bem. Além disso, são capazes de incorporar múltiplas esferas de controlo internos para verificação da amostra e adequação do sistema e, assim, garantir a precisão dos resultados. Estes incluem o controlo de tecido e ensaio de IgG anti-imunoglobulina de espécies de soro (αIg) conjuntos de esferas revestidas para avaliar a adequação da amostra. Tal como no ELISA e IFA, o controlo de tecido detecta a ligação não específica de imunoglobulina no soro. O controle αIg (controle de Soro) confirma que o soro tenha sido adicionado e contém uma concentração de imunoglobulinas suficiente enquanto o IgG esfera de controlo (controle de Adequação do Sistema), revestido com imunoglobulina espécie de soro, demonstra que os reagentes marcados e Luminex leitor estão funcionando corretamente.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting at JoVE.com

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Biologia

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Um método de quantificação sensível e específico para Determinação do Serum miosina cardíaca Binding Protein-C por Imunoensaio electroquimioluminescência

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...