Name: isolation and culture of human fungiform taste papillae cells
Uploaded: 2012-05-17T12:00:00
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Agradecemos Aimee Myers e Quayson Esi de competências técnicas e de ajuda. Este trabalho foi apoiado em parte pela NSF 0216310 e Inc Givaudan subvenção (NER).

1. Obtenção de Papilas gustativas humanas fungiformes <ol><li> Remover 4-8 papilas gosto humano fungiformes a partir da superfície dorsal da porção anterior da língua usando microtesoura mola curvos. </li><li> Colocar-se imediatamente para uma solução de isolamento (26 mM de NaHCO3, 2,5 mM de NaH 2 PO 4, 20 mM de glucose, 65 mM de NaCl, 20 mM de KCl, 1 mM de EDTA e dissolvido em água livre de nuclease e esterilizado por filtração). </li></ol> 2. Digest?...

<ol>
	<li>Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).</li><li>Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+difference+in+amiloride-sensitivity+of+salt-induced+responses+in+mouse+non-dissociated+taste+cells.">Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells.</a> Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).</li><li>Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).</li><li>Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+to+obtain+cells+of+taste+buds+from+fungiform+papillae+of+mice.">A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice.</a> Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).</li><li>Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+isolating+and+patch-clamping+single+mammalian+taste+receptor+cells.">A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells.</a> Brain Res. 503, 326-329 (1989).</li><li>Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+rat+taste+bud+cells+that+retain+molecular+markers+for+taste+buds+and+permit+functional+expression+of+foreign+genes.">Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes.</a> Neuroscience. 106, 217-225 (2001).</li><li>Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+rat+taste+buds+in+primary+culture.">Maintenance of rat taste buds in primary culture.</a> Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).</li><li>Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+lineage+relationships+in+taste+buds.">Analysis of cell lineage relationships in taste buds.</a> J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).</li><li>Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+long-term+maintenance+of+rat+taste+cells+in+culture.">Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture.</a> Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).</li><li>Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Human+Fungiform+Papillae+Cells+in+Culture.">Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture.</a> Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).</li><li>Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+odorant+elicited+calcium+changes+in+cultured+human+olfactory+neurons.">Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons.</a> J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).</li><li>Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+neuronal+cells+from+adult+human+olfactory+epithelium.">Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium.</a> J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).</li><li>Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomal+comparison+of+human+dermal+lymphatic+endothelial+cells+ex+vivo+and+in+vitro.">Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro.</a> Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).</li><li>Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+stem+cells+from+mesenchymal+stemcells:+evidence+for+a+bipotential+stem+cell+population.">Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population.</a> Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).</li><li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limits+of+isolation+and+culture:+intact+vascular+endothelium+and+BKCa.">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).</li></ol>

Temos mantido células obtidas a partir de papilas humano fungiformes sabor durante mais de 8 passagens, abrangendo um período de 12 meses. Estas culturas gerar novas células, muitos dos quais amadurecem in vitro para a fase em que expressam vários marcadores de maduros gustativas tipos de células da gema, para além de chave propriedades moleculares e fisiológicos de células receptoras gustativas. A presença de gustducin e PLC-β2 imunorreactividade em subconjuntos de células de cultura é consistente ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> MCDB 123 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DMEM Iscove Médio </td><td> Mediatech </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> E Pronase </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina de soja </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Colagenase tipo 1 </td><td> Worthington </td></tr><tr><td> Rat colágeno tipo 1 cauda </td><td> BD Ciências </td></tr><tr><td> Fura-2 PM </td><td> Molecular Probes </td></tr><tr><td> Superscript Synthesis System Primeiro Strand para RT-PCR </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Leica TCS SP2 microscópio confocal Spectral </td><td> Leica Microsystems Inc. </td&gt; </tr><tr><td> Descoberta-1 imagem estação e Metamorph software </td><td> Molecular Devices </td></tr><tr><td> Pequenas fina ponta de uma pinça e tesouras extras de primavera </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of human fungiform taste papillae cells

Células de sabor são altamente especializados, com únicas histológicos, características moleculares e fisiológicas que permitem a detecção de uma ampla gama de estímulos simples e moléculas químicas complexas contidos nos alimentos. Em humanos papilas fungiformes, individual contêm de zero a até 20 papilas gustativas. Não há protocolo estabelecido para a cultura de células humanas de sabor, embora a capacidade de manter as células sabor papilas em cultura durante vários ciclos celulares seria de utilidade considerável para caracterizar as propriedades moleculares, regenerativa, e funcional destas células únicas sensoriais. Estudos anteriores de células gustativas ter sido feito usando recém células isoladas em cultura primária, as culturas de explante de roedores, ou gomos semi-intactas gosto em fatias de tecido 1,2,3,4. Embora cada uma destas preparações tem vantagens, o desenvolvimento de culturas a longo prazo teria fornecido benefícios significativos, particularmente para os estudos de gosto a proliferação celular e diferentiation. Vários grupos, inclusive o nosso, têm sido interessados ​​no desenvolvimento e estabelecimento de modelos de cultura de células gustativas. A maioria das tentativas de células gustativas cultura relataram viabilidade limitada, com células normalmente não duradouros além d 3-5 5,6,7,8. Nós recentemente relatado em um método de sucesso para a cultura prolongada de células de roedores gustativas 9. Nós relatamos aqui pela primeira vez o estabelecimento de um sistema de cultura in vitro de células humanas isoladas fungiformes papilas gustativas. As células de humano papilas fungiformes obtidos por biópsia com êxito foram mantidas em cultura durante mais de oito passagens (12 meses) sem perda de viabilidade. Células exibido muitas características moleculares e fisiológicos característicos de células sabor maduros. Gustducin e fosfolipase C β2, (PLC-β2) ARNm foram detectados em muitas células por reacção em cadeia da polimerase com transcriptase reversa e confirmado por sequenciação. Análise imunocitoquímica demonstrou a presença de rajadaducin e PLC-β2 expressão em células gustativas cultivadas. Culturas de células de fungiformes humanos também exibiram aumentos na concentração de cálcio intracelular em resposta a concentrações apropriadas de estímulos de sabor, indicando que vários receptores de sabor e pelo menos algumas das vias de sinalização estavam presentes. Estes resultados indicam que as células suficientes sabor a partir de seres humanos adultos pode ser gerado e mantido durante pelo menos oito passagens. Muitas das células retêm as características fisiológicas e bioquímicas de células agudamente isoladas a partir do epitélio sabor adulto para apoiar a sua utilização como um sistema modelo gosto. Este sistema irá permitir estudos mais detalhados de os processos envolvidos na diferenciação, proliferação e função das células receptoras de mamíferos sabor num na preparação in vitro. Papilas fungiformes gosto humano utilizado para estabelecer cultura de células humanas fungiformes foram doados para pesquisa após consentimento informado apropriado ao abrigo de protocolos de pesquisa que foram analisadase aprovado pelo comitê de IRB. O protocolo (# 0934) foi aprovado por Schulman Associates Institucional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Protocolo escrito abaixo é baseado em parâmetros publicados relatados por Ozdener et al. 2011 10.

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Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo reprodutível para isolar e manter a longo prazo culturas de células humanas fungiformes papilas gustativas. As células de humano papilas fungiformes obtidos por biópsia com êxito foram mantidas em cultura durante mais de oito passagens (12 meses) sem perda de viabilidade.

Isolamento e Cultura de Células Papila fungiforme Humanos Taste

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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